吕佳乐,刘正才,姚闽娜*,林元地

(1.福建农林大学食品科学学院,福建 福州 350002;2.福州海关技术中心,福建 福州 350001)

沙奎那韦、利托那韦、奈非那韦和茚地那韦是一类高效和高选择性的蛋白酶抑制剂,属于抗病毒类药物[1]。而病毒缺少完整的酶系统,将无法独立存活,因此它必须侵入易感的宿主细胞,依靠宿主细胞的酶系统、原料和能量复制病毒的核酸,借助宿主细胞的核糖体翻译病毒的蛋白质[2]。因蛋白酶抑制剂能与蛋白酶分子活性中心上的一些基团结合,使蛋白酶活力下降,甚至消失,从而达到抵抗病毒的作用。早在2005年,中华人民共和国农业部公告第560号就规定,禁止将人用抗病毒药移植兽用,但为了节约成本,许多不法商家依然将其用于畜禽的预防感染和治疗疾病上。2012年央视曝光的“速生鸡”事件就是一些养殖企业为快速获得经济利益,缩短鸡的养殖周期,在鸡饲料中违规添加利巴韦林和盐酸金刚烷胺等抗病毒药物。长期大量使用这些药物,会导致动物中毒,并诱发病毒菌株产生变异,这将严重威胁人类健康[3,4]。因此,建立鸡肉中蛋白酶抑制剂的残留检测方法非常重要。

目前国内外检测沙奎那韦、利托那韦、奈非那韦、茚地那韦的主要方法有高效液相色谱法[5]、反向高效液相色谱法[6]、高效液相色谱-串联质谱法[7-9]、高效液相色谱-紫外法[10]等。目前关于这4种药物的报道主要集中在血浆和尿液中药物含量的测定方面,而动物性食品中残留检测方法的报道相对较少。梁公文等[8]采用反向高效液相色谱-串联质谱法检测小鼠血浆和脑组织中沙奎那韦的含量,操作过程繁琐;时美慧等[11]采用Thermo Hypersil GOLD色谱柱，以正离子模式、选择反应监测(SRM)方式建立了快速测定人血浆中洛匹那韦和利托那韦浓度的LC-MS/MS方法,但只选取了一对二级碎片离子进行分析和检测;Chi等[12]建立了LC-MS/MS法测定人血浆中蛋白酶抑制剂的含量,但种类不够全面。因此建立一种检测全面、灵敏度高、特异性强的多残留检测方法以应用于动物组织中蛋白酶抑制剂药物的测定尤为重要。

本实验以鸡肉为研究对象,结合固相萃取的强净化能力和UPLC-MS/MS的抗基质干扰能力,建立了检测沙奎那韦、利托那韦、奈非那韦、茚地那韦的多残留分析方法。该法灵敏度高,选择性好,定性定量准确,抗干扰能力强,定量限(LOQ)满足各个化合物残留限量的要求,可用于鸡肉中4种蛋白酶抑制剂的残留检测。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

API5500超高效液相色谱-串联质谱仪,配有电喷雾电离(ESI)源(美国Applied Biosystems公司);CR21N高速冷冻离心机(日本工机有限公司);XK80-A旋涡混合器(江苏新康医疗器械有限公司);HN200多功能氮吹仪(济南海能仪器股份有限公司);Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)。

沙奎那韦(CAS号:127779-20-8)、利托那韦(CAS号:155213-67-5)、奈非那韦(CAS号:159989-64-7)、茚地那韦(CAS号:150378-17-9)标准品(纯度≥98.0%,加拿大Toronto Research Chemicals公司);混合型阳离子交换柱(MCX柱,60 mg/3 mL;美国Waters公司);乙腈、甲醇、氨水(色谱纯,德国Merck公司);三氯乙酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);实验用鸡肉样品购自超市。

标准溶液的配制:准确称取沙奎那韦、利托那韦、奈非那韦、茚地那韦标准品各5.00 mg,用甲醇分别溶于50 mL棕色容量瓶中,配制成质量浓度为100 mg/L的标准储备液,于-20 ℃下保存,备用。再用50%(v/v)甲醇逐级稀释,配制成质量浓度为1.0 mg/L的标准工作液;临用时,以空白基质溶液稀释成质量浓度为0、0.5、1.0、2.0、4.0、10.0 μg/L的标准工作曲线溶液,现用现配。

1.2 样品前处理

1.2.1提取

称取5.0 g均质后的鸡肉样品,置于50.0 mL塑料离心管中,再加入25.0 mL 30%(v/v)乙腈水溶液(含1%(v/v)三氯乙酸)、0.5 g中性氧化铝,振荡混匀3 min,于0～4 ℃以15 000 r/min离心8 min,取上清液过滤,滤液待净化。

1.2.2净化

依次用3.0 mL甲醇、3.0 mL水、3.0 mL 1%(v/v)三氯乙酸水溶液活化MCX柱;取5.0 mL滤液，加入5.0 mL水，混匀，上样,依次用3.0 mL 1%(v/v)三氯乙酸水溶液、3.0 mL水、3.0 mL甲醇-水(1∶1,v/v)淋洗MCX柱,然后用3.0 mL氨水-甲醇(5∶95,v/v)洗脱,收集洗脱液,置于45 ℃下氮吹,最后添加1.0 mL乙腈-水(4∶6,v/v)溶液溶解,过0.22 μm滤膜后上机检测。

表1 4种蛋白酶抑制剂的主要质谱参数Table 1 Main MS parameters of the four protease inhibitors

* Quantitative ion.

图1 4种蛋白酶抑制剂的二级离子碎片质谱图及其主要裂解方式Fig.1 Secondary ion fragment mass spectra of the four protease inhibitors and their main fragmentation pathways

1.3 色谱条件

色谱柱:Luna®C8柱(150 mm×2 mm,3 μm);柱温:40 ℃。流动相:A为0.2%(v/v)甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸铵),B为乙腈;流速:0.4 mL/min。梯度洗脱程序:0～1.5 min,95%A;1.5～5.0 min,95%A～30%A;5.0～9.0 min,30%A～95%A。进样量:5 μL。

1.4 质谱条件

电离模式:ESI+;检测方式:多反应监测(MRM)模式;离子源温度:500 ℃;离子源喷雾电压(ionspray voltage):5 500 V;气帘气(curtain gas)压力:0.276 MPa;雾化气(gas 1)压力:0.345 MPa;加热辅助气(gas 2)压力:0.345 MPa。定性和定量离子对、碰撞能量(CE)、去簇电压(DP)见表1。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的选择

分别配制1.0 mg/L的4种目标化合物的标准溶液，注入ESI源中。首先进行一级质谱图全扫描,确定母离子,然后对准母离子进行子离子扫描,二级离子碎片扫描质谱图及可能的断裂规律见图1。分别选择沙奎那韦、利托那韦、奈非那韦、茚地那韦丰度相对最强的1对碎片离子m/z671.4/570.5、721.5/296.2、568.6/330.2、614.6/421.1作定量离子对,次强的一两对碎片离子作定性离子对,然后分别优化子离子的碰撞能量,最终在MRM模式下优化雾化气压力、干燥气温度和流量等参数。

2.2 色谱条件的选择

色谱柱的选择对样品的分离十分重要,通常不同类型的填料对同一样品有不同的保留效果。有文献[12]使用Zorbax XDB C8柱测定人血浆中蛋白酶抑制剂的含量。本文重点比较了Kinetex®C18(100 mm×2 mm,2.6 μm)、Luna®C8(150 mm×2 mm,3 μm)2种反相液相色谱柱和ACQUITY UPLC®BEH HILIC柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)对4种目标化合物的分离情况。结果表明,4种目标化合物在采用C18色谱柱时能获得较好的分离效果,但利托那韦出现严重的色谱峰拖尾现象,改变流动相梯度条件仍然不能有效改善;采用HILIC柱可改善利托那韦的分离效果,但对整类化合物分离效果不太理想,而且响应值降低,可能是因为化合物出峰时离子源的水相比例较高,高浓度的盐抑制了化合物的响应信号;采用C8柱时,4种物质均可有效分离且响应值较高。因此,选用C8柱,以酸性乙酸铵溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱,4种化合物能较好地保留与分离。

2.3 提取条件的选择

图2 不同提取溶剂对4种蛋白酶抑制剂回收率的影响(n=3)Fig.2 Influence of different extraction solvents on the recoveries of the four protease inhibitors (n=3) All the extraction solvents contained 1% (v/v)trichloroacetic acid.

4种蛋白酶抑制剂的化学结构见图1,其均含有2个或2个以上的氨基,属于有机碱,因此在提取溶液中添加适量的酸有利于药物的提取。考虑到鸡肉组织中蛋白质含量高、杂质多等特点,综合三氯乙酸具有沉淀蛋白质及杂质的作用[13],因此首先考虑添加三氯乙酸使提取溶液呈酸性。实验发现,三氯乙酸的体积分数为1%时,4种化合物的提取回收率最高。为取得较好的提取效果,实验分别考察了三氯乙酸的体积分数为1%时,乙酸乙酯、乙腈、丙酮、甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷作为提取溶剂对鸡肉中4种蛋白酶抑制剂回收率的影响(见图2)。结果表明,对于鸡肉样品,采用乙酸乙酯、丙酮、甲醇、三氯甲烷提取时,4种目标化合物的回收率均不能同时超过60%;采用乙腈提取时,4种目标物的回收率为67.6%～85.7%;采用二氯甲烷提取时,4种目标物的回收率为71.1%～94.3%。虽然二氯甲烷的提取效果相对较好,但鸡肉中油脂含量高,二氯甲烷比乙腈更容易将鸡肉中的油脂提取出来,不利于后续净化。乙腈对蛋白质的沉淀作用较强,进一步优化乙腈的比例,发现当采用30%(v/v)乙腈水溶液提取时,4种目标物的回收率最佳。因此最终确定提取溶液为30%(v/v)乙腈水溶液(含1%(v/v)三氯乙酸)。

2.4 净化条件的优化

图3 4种目标化合物在固相萃取柱上的洗脱曲线Fig.3 Elution curves of the four target compounds on SPE column

根据化合物的特点,本文重点比较了亲水亲脂平衡HLB柱和MCX柱对样品中所有目标物的净化效果。研究发现,当使用HLB柱时,利托那韦、茚地那韦的回收率可达62.3%和91.1%,但沙奎那韦和奈非那韦的回收率较低,无法满足分析要求,而使用MCX柱时,沙奎那韦、奈非那韦、茚地那韦的回收率为83.5%～104.0%,但利托那韦的回收率相对较低。为解决此问题,实验从上样溶液的体积、淋洗液以及洗脱液等方面进行了选择和优化。研究发现，在上样的滤液中加入5 mL水,淋洗液甲醇的体积分数降为50%时,利托那韦在MCX柱上能较好地保留,且其他3种化合物均有较好的回收率。以氨水-甲醇(5∶95,v/v)为洗脱液时的洗脱曲线见图3。可以看出,使用1 mL时，大量蛋白酶抑制剂被洗脱,使用3 mL时,蛋白酶抑制剂基本全部洗脱。因此,最终洗脱体积设为3 mL。

2.5 基质效应

超高效液相色谱-串联质谱法虽然具有高分辨率、高灵敏度等特点,但普遍存在基质效应,会对实验结果产生不同程度的影响。目前常采用两种方法消除基质效应,分别为柱后灌注法和提取后加标法[14,15]。本实验采用提取后加标法,将空白鸡肉样品按1.2节进行前处理，获得的基质提取液配制基质曲线,用乙腈-水(4∶6,v/v)配制同等浓度的标准曲线,基质效应=(k1-k2)/k1×100%(k1为基质曲线的斜率,k2为标准曲线的斜率)。结果表明,沙奎那韦、利托那韦、奈非那韦和茚地那韦在鸡肉中均有不同程度的基质增强效应,ME分别为19%、13%、6%和7%。因此,本文采用空白基质添加标准溶液的方式配制标准工作曲线溶液来减弱基质效应的影响。

2.6 线性方程、检出限和定量限

配制质量浓度为0.5、1、2、4、10、20 μg/L的系列混合标准溶液,在选定的色谱条件和质谱条件下进行测定。以目标组分峰面积(y)对相应的质量浓度(x,μg/L)作线性回归分析(见表2)。结果表明,4种目标化合物在各自的线性范围内线性关系良好,相关系数(r2)均大于0.99。在鸡肉空白样品中加入不同水平的蛋白酶抑制剂标准品,按照1.2节前处理后进行测定,以3倍和10倍信噪比(S/N)为检出限(LOD)和定量限(LOQ),4种蛋白酶抑制剂的检出限和定量限分别为0.06～0.30 μg/kg和0.20～0.90 μg/kg(见表2)。

表2 4种蛋白酶抑制剂的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients (r2),limits of detection (LODs)and limits of quantification (LOQs)of the four protease inhibitors

y:peak area;x:mass concentration,μg/L.

2.7 回收率和精密度

向空白鸡肉样品中进行1.0、2.0、10.0 μg/kg 3个水平的加标回收试验,每个加标水平做6组平行,按1.2节进行样品前处理,在1.3节和1.4节条件下进行测定,采用标准添加空白样品法校正基质效应;日间精密度试验每个样品重复分析2次,连续3 d分析,结果见表3。鸡肉中4种目标化合物的平均回收率为69.0%～106.0%,日内和日间相对标准偏差(RSD)分别为2.2%～13.8%和3.6%～14.6%。说明该方法具有较好的准确度与精密度。空白鸡肉样品和加标鸡肉样品(1.0 μg/kg)的MRM色谱图见图4。

表3 鸡肉中4种蛋白酶抑制剂的加标回收率和日内、日间精密度Table 3 Spiked recoveries and intra-day and inter-day precisions of the four protease inhibitors in chicken samples

2.8 实际样品测定

用本文建立的检测方法对购于市场上的30份鸡肉样品进行检测,4种目标化合物均未检出。

3 结论

本文建立了超高效液相色谱-串联质谱检测鸡肉中蛋白酶抑制剂的分析方法。该法简单高效,灵敏度高,选择性好,适用于鸡肉中4种蛋白酶抑制剂的残留分析。