张 靖,郭攀攀,李惠丽,申世刚*,窦海洋,*

(1.河北大学化学与环境科学学院,河北 保定 071002;2.河北大学医学院,河北 保定 071000)

小米又称粟,原产于我国,是我国北方半干旱、干旱地区种植的主要粮食作物,营养丰富,兼具药用价值。珍珠栗、狐尾栗、黍子和手指小米等都是小米的重要品种。小米主要成分为淀粉,其含量约为60%～70%。小米淀粉是食品进一步加工的基础原料,小米淀粉的理化性质和结构影响食用的品质[1]。因此,准确表征小米淀粉的理化性质和结构对于获得满足特定功能的小米产品至关重要。

目前,常用分离淀粉的方法主要有尺寸排阻色谱法(size-exclusion chromatography,SEC)和非对称场流分离技术(asymmetrical flow field-flow fractionation,AF4)。SEC是一种基于样品尺寸分离的方法,其分离范围为103～106g/mol。SEC在表征直链淀粉时可以获得准确的摩尔质量分布,但是在表征支链淀粉时,剪切作用导致支链淀粉降解,测得的摩尔质量偏低[2,3]。不同于SEC,AF4是基于样品的分子扩散和垂直于主体流动的流场相互作用的分离方法。AF4没有固定相和填充材料,具有广泛的尺寸检测范围(1 nm～50 μm),适用于剪切力敏感的样品的分离。近年来,AF4已应用于分离表征脂蛋白[4-6]、纳米颗粒[7,8]、多糖[9]等。此外,AF4与多角度激光光散射检测器(multi-angle light scattering,MALS)和示差折光检测器(differential refractive index,dRI)(AF4-MALS-dRI)可以同时提供样品的回转半径(radius of gyration,Rg)分布、摩尔质量(molar mass,Mw)分布、表观密度、分子结构(Rg/Rh)等信息[10]。

文献[11]报道,小米淀粉颗粒大小不一,且摩尔质量分布范围广,采用一般的分离方法很难准确表征小米淀粉。目前未见关于AF4分离表征小米的报告。本文建立了AF4-MALS-dRI联用技术分离表征小米淀粉的方法。该方法具灵敏度高、重现性好等特点。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Eclipse AF4场流分离系统(德国Wyatt公司);DAWN EOS多角度激光光散射检测器(美国Wyatt公司);1260 InfinityⅡ示差折光检测器;Agilent 1260液相泵(德国Agilent公司);MS-H550-Pro磁力搅拌器(北京大龙兴创实业有限公司);Milli-Q Advantage A10超纯水系统(美国Millipore公司);DHG-914385-Ⅲ电热鼓风干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司);SQP电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司);PE28 pH计(梅特勒-托利多精密仪器有限公司)。

硝酸钠、氢氧化钠、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠、叠氮化钠(上海麦克林生化科技有限公司),盐酸(北京化工),牛血清蛋白(Mw=6.6×104g/mol)、马脾铁蛋白(美国Sigma-Aldrich公司),所用试剂均为分析级。小米由河北省农林科学院谷子研究所提供。

1.2 小米淀粉样品制备

小米淀粉的提取:准确称取20 g小米,置于200 mL烧杯中,加入26.6 mL pH 7.2磷酸缓冲溶液,密封,浸泡48 h。将浸泡的小米进行研磨过筛(200目),加入到10 mL的离心管中,以6 000 r/min的速度离心7 min,去除上清液。加入90%(体积分数)乙醇,在相同的转速下离心3次,最后将获得的小米淀粉置于45 ℃的鼓风干燥箱中烘干48 h。

小米淀粉的溶解:准确称取10 mg小米淀粉,置于20 mL试剂瓶中,加入1.0 mL 1 mol/L NaOH溶液,在室温下以200 r/min的速度磁力搅拌6 min。将试剂瓶置于70 ℃水浴中以160 r/min的速度搅拌4 min。加入8.0 mL载液,继续搅拌2 h。加入1.0 mL 1 mol/L HCl溶液,搅拌2 min,取出,室温冷却[9]。

表1 洗脱程序Table 1 Elution procedure

Vc,initial:initial cross flow rate;Vc,final:final cross flow rate.

1.3 小米淀粉AF4分析条件

本研究采用AF4长池道:其中聚酯垫片厚度为350 μm,可再生纤维素膜的截留量为10 kDa;流动相为10 mmol/L pH 7.00 NaNO3水溶液(加入3 mmol/L NaN3,抑制载液中微生物的生长),样品进样体积为50 μL,进样质量浓度为0.50 g/L,进样流速为0.2 mL/min,检测器流速为1.0 mL/min,交叉流流速由1.2 mL/min指数衰减到0 mL/min,半衰期(t1/2)为3 min,洗脱程序见表1。所获得的AF4数据采用ASTRA 6.1.7进行处理,折射率增量值(dn/dc)为0.146 mL/g,数据拟合方式为Berry[14]。

2 AF4原理

AF4分离池道主要由聚碳酸酯上壳、聚酯梯形垫片、超滤膜(积累壁)和不锈钢渗透熔块下板组成。其分离原理如图1所示:在分离的流道内,中心线位置处的流速最大,从中心线向两侧流速逐渐减小。当样品从进样口B进入流道后,在外加场力的作用下向积累壁运动,与此同时样品自身布朗运动产生向上的扩散力,在这两个力的共同作用下最终形成平衡层。粒径小的颗粒具有较高的扩散系数,形成的平衡层靠近流道中心,此处具有较大流速而被先洗脱出来。

图1 非对称场流分离原理Fig.1 Principle of AF4 (asymmetrical flow field-flow fractionation)

AF4-MALS-dRI可以同时提供样品的Rg和Mw分布[12]:

(1)

其中,K为光学常数;c为样品质量浓度(kg/L);Rθ为瑞利比,指散射光强度与入射光强度的比,受到入射光的强度、散射的体积、散射角等因素的影响;λ为入射光波长;θ为光散射角。

在AF4正常洗脱模式中,流体力学半径Rh可以通过测量的保留时间tr和Stokes-Einstein方程推导出[13]:

(2)

其中,k为玻尔兹曼常数,T为绝对温度(K),v0为空隙体积(mL),t0为空隙时间(min),w为池道高度(cm),η为载液的黏度(g/(cm·min)),vc为交叉流流速(mL/min)。

3 结果与讨论

3.1 AF4系统性能的验证

为了获得准确的分析数据,采用牛血清蛋白作为测试的标准样品,恒定交叉流流速为5 mL/min，其他按1.3节分析条件对AF4系统性能进行验证。结果如图2所示,在tr=4.5、6.2和7.5 min处出现了3个洗脱峰,分别对应牛血清蛋白的单体、二聚体、三聚体,测定的牛血清蛋白单体的Mw为6.7×104g/mol,与厂家提供值6.6×104g/mol基本一致,表明AF4系统有良好的分离性能。结果显示,牛血清蛋白的二聚体、三聚体的AF4-MALS信号与AF4-UV、AF4-dRI信号强度有明显的差异,这是因为AF4-MALS信号受样品粒径大小和浓度因素的影响,而AF4-dRI和AF4-UV信号只受样品浓度影响。本文MALS信号来源于光散射角90°的信号源(MALS 90°)。

图2 牛血清蛋白的AF4-UV-MALS-dRI分离谱图和Mw分布图Fig.2 AF4-UV-MALS-dRI (AF4 coupled with ultraviolet-visible,multi-angle light scattering,and differential refractive index detectors)fractograms and Mw(molar mass)distributions of bovine serum albumin

图3 不同溶解温度对小米淀粉溶解影响的AF4-MALS-dRI分离谱图、Rg和Mw分布图Fig.3 AF4-MALS-dRI fractograms ,Rg(radius of gyration)and Mw(relative molecular mass)distributions of millet starch obtained at different dissolution temperatures a.AF4-dRI and Rg of millet starch;b.AF4-MALS and Mw of millet starch;c.AF4-dRI and Rg of millet starch filtered through a 0.45 μm filter;d.AF4-MALS and Mw of millet starch filtered with 0.45 μm.MALS 90°:MALS signal was observed at the scattering angle of 90°.

3.2 小米淀粉的溶解

研究了不同溶解温度对小米淀粉溶解的影响。按1.3节条件进行分析,结果如图3所示,小米淀粉Rg分布范围为15～160 nm,Mw分布范围为5×105～2×108g/mol。当水浴温度为70 ℃时,AF4-dRI信号在tr=6.0～11.0 min处出现凸起,对应的Rg分布和Mw分布出现相同的现象。这可能是由于小米淀粉未全溶解发生共洗脱现象。共洗脱是指在AF4分离过程中,粒径大的颗粒与粒径小的颗粒同时洗脱出来[14,15]。为了证明此现象,采用0.45 μm的聚醚砜(PES)针式过滤膜将小米淀粉溶液过滤,结果如图3c和3d所示,tr=6.0～11.0 min处的凸起消失,对应的Rg分布和Mw分布呈现缓慢上升趋势,表明水浴温度为70 ℃时,小米淀粉未完全溶解。当水浴温度为75 ℃时,AF4-MALS-dRI信号增强,但仍存在共洗脱现象,表明小米淀粉仍未完全溶解。当水浴温度为80 ℃时,AF4-dRI信号进一步增强,且共洗脱现象消失,表明小米淀粉溶解较好。在该温度下,AF4-dRI信号主要呈现两个洗脱峰,第一个洗脱峰对应的是直链淀粉,第二个洗脱峰对应的是支链淀粉。当水浴温度升高到85 ℃时,AF4-MALS-dRI信号的第一个洗脱峰明显增强,第二个洗脱峰信号降低,表明支链淀粉发生了降解。综上,水浴温度为80 ℃为溶解小米淀粉的适宜温度。

3.3 AF4分析条件的优化

3.3.1进样量

样品进样量是影响AF4分析结果的主要因素之一。当进样量过少时,样品洗脱峰的信号低;当进样量过高时,样品出现过载现象导致样品的洗脱峰发生偏移,保留时间也会发生改变,影响分析结果的准确性[16]。本研究通过改变进样浓度研究了进样量对小米淀粉AF4分析结果的影响。进样质量浓度分别为0.25、0.50和1.00 g/L,其他条件同1.3节。结果如图4所示,当进样质量浓度为0.25 g/L时,AF4-MALS-dRI信号较弱。当进样质量浓度为0.50 g/L时,AF4-MALS-dRI信号增加。当进样质量浓度增加到1.00 g/L时,AF4-MALS-dRI信号继续增加,但部分样品从空隙峰中洗脱出来。综合考虑样品空隙峰与样品峰的分离度和样品洗脱峰的信号强度,选择进样质量浓度为0.50 g/L。

图4 不同进样浓度对小米淀粉影响的AF4-MALS-dRI分离谱图、Rg和Mw分布图Fig.4 AF4-MALS-dRI fractograms ,Rg,and Mw distributions of millet starch obtained at different sample concentrations

3.3.2交叉流流速

根据AF4理论,交叉流流速是影响分离效果的重要因素。增加交叉流流速可以提高样品的分离度。研究了不同的交叉流流速对小米淀粉AF4分离结果的影响。交叉流流速分别为1.0、1.2和1.4 mL/min,其他分析条件同1.3节。结果如图5所示,当样品的交叉流流速为1.0 mL/min时,AF4-dRI信号中的样品空隙峰与样品峰分离度较差,这是由于交叉流流速小,分样品从空隙峰中洗脱出来。当交叉流流速为1.2 mL/min时,AF4-dRI信号的样品空隙峰与样品峰进一步分离,但峰展宽增加,其原因是交叉流流速增加,使样品更接近于过滤膜表面,样品与过滤膜之间的相互作用增强,洗脱时间延长。当交叉流流速增加到1.4 mL/min时,AF4-dRI信号降低且峰展宽进一步增加。综合考虑样品空隙峰与样品峰的分离度和样品洗脱峰的信号强度,选择交叉流流速为1.2 mL/min。

图5 不同交叉流流速下小米淀粉的AF4-MALS-dRI分离谱图、Rg和Mw分布图Fig.5 AF4-MALS-dRI fractograms ,Rg,and Mw distributions of millet starch obtained with different cross-flow rates

3.3.3t1/2

在梯度洗脱程序中,t1/2影响着样品洗脱时间和分离度。研究了不同t1/2对小米淀粉AF4分离结果的影响。t1/2分别为2、3和4 min,其他分析条件同1.3节。结果如图6所示,当t1/2=2 min时,AF4-dRI信号在tr=2～5 min处出现了大的凸起,其原因可能是由于交叉流流速指数衰减速度太快,样品峰的分离度降低。当t1/2=3 min时,AF4-MALS-dRI信号增强,Rg分布和Mw的分布与图5基本一致,表明小米淀粉在该t1/2下洗脱完全。当t1/2=4 min时,AF4-MALS-dRI信号减弱且洗脱峰变宽,其原因可能是由于t1/2增大,交叉流流速指数衰减速度变慢,洗脱时间延长。综合考虑样品空隙峰与样品峰的分离度和样品洗脱峰的信号强度,选择t1/2为3 min。

图6 不同t1/2小米淀粉的AF4-MALS-dRI分离谱图、Rg和Mw分布图Fig.6 AF4-MALS-dRI fractograms ,Rg,and Mw distributions of millet starch obtained with different half-lives (t1/2)

3.3.4载液离子强度

载液离子强度影响样品颗粒表面双电子层厚度和表面电势,进而影响样品的分离效果[17]。研究了不同离子强度对小米淀粉AF4分离结果的影响。pH 7.00 NaNO3载液浓度分别为10、50和100 mmol/L,其他条件同1.3节。结果如图7所示,随着载液浓度从10 mmol/L增加到100 mmol/L,AF4-dRI空隙峰与样品峰的分离度逐渐增加,但样品峰的信号减弱,其原因可能是由于载液离子强度增加,样品颗粒表面的双电子层厚度减小,使样品更接近于AF4过滤膜表面,增加了样品与AF4过滤膜交联。综合考虑样品空隙峰与样品峰的分离度和样品洗脱峰的信号强度,选择载液浓度为10 mmol/L pH 7.00 NaNO3。

图7 不同离子强度小米淀粉的AF4-MALS-dRI分离谱图、Rg和Mw分布图Fig.7 AF4-MALS-dRI fractograms,Rg,and Mw distributions of millet starch obtained with different ionic strengths

3.3.5载液pH

研究了载液的不同pH值对小米淀粉AF4分离结果的影响。载液pH值分别为5.00、7.00和9.00,其他条件同1.3节。结果如图8所示,当载液的pH值从5.00增加到9.00时,AF4-MALS-dRI信号的空隙峰与样品峰的分离度及信号强度呈先增加后减小的趋势,可能是由于载液的pH过酸或过碱,都会影响样品颗粒与过滤膜表面之间的作用力。综合考虑样品空隙峰与样品峰的分离度和样品洗脱峰的信号强度,选择载液的pH=7.00。

图8 不同pH小米淀粉的AF4-MALS-dRI分离谱图、Rg和Mw分布图Fig.8 AF4-MALS-dRI fractograms,Rg,and Mw distributions of millet starch obtained with different pH values

3.4 重现性

为了验证小米淀粉溶解及AF4-MALS-dRI方法的重现性。在1.3节条件下,对3个小米淀粉样品进行测定。结果如图9所示,3个样品的AF4-dRI信号和AF4-MALS信号的趋势及强度基本一致,Rg相对标准偏差为3.4%,Mw相对标准偏差为7.0%。

图9 小米淀粉样品的AF4-MALS-dRI分离谱图、Rg和Mw分布图的重现性Fig.9 Repeatabilities of AF4-MALS-dRI fractograms,Rg,and Mw distributions for analysis of millet starch

3.5 小米淀粉的结构表征

在优化的条件下,探究了小米淀粉的结构。基于AF4与MALS和dRI联用(见公式1)结合AF4理论(见公式2)可以获得小米淀粉的结构参数(Rg/Rh)和表观密度。结果如图10所示,表观密度分布和Rg/Rh的分布主要在107～108g/mol范围内,随着Mw的增加,表观密度先快速地降低后趋于平缓,表明小米淀粉分子随着摩尔质量的增加从紧密的状态变得疏松;Rg/Rh的比值范围为0.9～1.6。文献[18]报道,Rg/Rh的比值分布范围为1.0～1.5时,样品分子结构为多分支结构。在摩尔质量107～108g/mol范围,小米淀粉Rg/Rh的比值范围为0.9～1.6,主要为多分支结构。

图10 小米淀粉的表观密度和Rg/RhFig.10 Apparent density and Rg/Rh of millet starch

4 结论

通过对AF4分析条件的优化,建立了AF4-MALS-dRI联用技术分离表征小米淀粉的方法。在该优化条件下,考察了AF4-MALS-dRI分离表征小米淀粉的重现性,同时探究了小米淀粉的表观密度和构象。结果表明,该方法具有良好的重现性,在摩尔质量107～108g/mol范围,小米淀粉分子主要为多分支结构。实验结果可为小米食品加工行业提供数据支持。