丁振中 雷鹏 张超 邓红兵

[摘 要] 本研究以油菜苗为试验对象，通过施用壳寡糖对常温（对照）及低温条件下的油菜苗进行处理，以此探究壳寡糖对油菜幼苗抗低温胁迫的影响。结果表明，施用壳寡糖的油菜苗在低温处理144 h后，其鲜质量及叶绿素含量分别较低温对照组提高了37.93%和48.25%;丙二醛含量较低温对照组降低了35.3%;脯氨酸含量较低温对照组提升了62.5%;总抗氧化能力较低温对照组显著提升，且壳寡糖能激发Ca2+向胞质流动。

[关键词] 油菜;壳寡糖;低温胁迫

[中图分类号] S512.1 [文献标识码] B [文章编号] 1674-7909（2020）31-80-3

低温冻害是我国农业生产过程中常见的一种非生物胁迫，对我国农业生产影响巨大。据相关数据统计，2006—2015年，受低温冷害影响，我国作物受灾面积达0.41亿hm2，成灾面积高达0.19亿hm2，绝收面积368.47万hm2。以2008年为例，我国有21个省、市、自治区受低温冷害危害，农业直接经济损失超过300亿元。近几年，气候学家研究发现，我国低温冷害发生概率逐渐增加，因此，提高作物抗低温胁迫的能力将是保证我国农业发展的重要研究方向。

近年来，各类农业相关产品不断出现。其中，生物刺激素是一类能够作用于植物或植物根际，使植物自身生命活动增强从而间接增强植物营养吸收或增强非生物胁迫抵抗能力的物质。目前，已被认可的典型生物刺激素有腐植酸、几丁质、壳寡糖等[1]，当前我国关于壳寡糖对油菜苗抗低温胁迫的相关研究较少。因此，本研究以油菜苗为研究对象，探究壳寡糖对油菜苗抗低温胁迫能力的影响，并初步探究其抗低温胁迫机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料及培养条件

本试验以甘蓝型油菜苏油1号为研究对象，种子消毒催芽约3 d后，将露白的种子播种于营养土中并放于光照培养室，控制光照时间为16 h，光培养温度控制在25℃，暗培养温度控制在15 ℃，湿度控制在65%。油菜苗生长28 d后，选取长势一致的油菜苗转入水培盒（34 cm×23 cm×10 cm）进行水培培养，水培时使用1/2改良的霍格兰（Hoagland）营养液。水培7 d，待油菜苗适应水培环境后，开始进行试验处理。

1.2 低温胁迫试验处理

试验分组如表1所示。其中，油菜苗除培养温度及壳寡糖用量不同外，其他条件均保持一致。营养液每24 h按处理更换一次，试验中于24 、48 、72 、96 、120 h及144 h取样进行生长及生理指标检测。

表1 低温胁迫试验设计                         /℃

[組号 组名 基础营养液 培养温度/℃ 壳寡糖添加（mg/kg） 1 CK 1/2 Hoagland营养液 25 0 2 COS 1/2 Hoagland营养液 25 20 3 LT 1/2 Hoagland营养液 4 0 4 LT+COS 1/2 Hoagland营养液 4 20 ]

注：CK代表常温，LT代表低温胁迫，COS代表常温下壳聚糖处理，LT+COS代表低温胁迫下壳聚糖处理。

1.3 测定指标

1.3.1 生物量测定。测定鲜质量时，每个处理每次取样不少于6株苗，每株单独称量，先将油菜苗根部的营养液吸干，然后称量样品，取平均值，即可获得油菜苗鲜质量。

1.3.2 叶绿素含量测定。称取0.5 g叶片组织，剪碎后置于50 mL乙醇-丙酮（1：1）混合溶液中，在黑暗室温条件下脱色48 h;浸提液经10 000 g离心5 min，过滤后，测定滤液在645 nm和663 nm波长下的吸光值。叶绿素含量依据Arnon提出的公式计算[2]。

1.3.3 丙二醛（MDA）含量测定。MDA含量的测定参考自Liu等人的方法[3]。

1.3.4 脯氨酸测定。脯氨酸含量的测定参考自Bates的方法[4]。

1.3.5 总抗氧化能力（T-AOC）测定。总抗氧化能力测定使用FRAP法进行测定。

1.3.6 胞内自由Ca2+[（Ca2+）cyt]含量测定。为测定（Ca2+）cyt含量，首先按照姜秀梅等的方法制备叶肉原生质体。分离得到的原生质体使用荧光染料Fluo-3/Amester在4 ℃下培养1 h，然后继续在25 ℃条件下培养1 h;接着将原生质体置于激光共聚焦扫描显微镜下观察，每隔30 s扫描一次荧光强度;利用计算机控制扫描及数据采集系统，对样品Ca2+荧光强度和分布进行高分辨图像和数据记录[5]。其中，培养液中包含10 mmol/L钙离子荧光探针（Fluo-3/Amester）、0.4 mol/L甘露醇、20 mmol/L氯化钾和5 mmol/L MES缓冲液（pH 值为5.7）。

2 结果与讨论

2.1 低温胁迫下壳寡糖对油菜苗生长量及叶绿素含量的影响

如表2所示，常温时，壳寡糖（COS）提高了油菜苗的鲜质量及叶绿素含量，尤其是处理96 h后。处理144 h后，对照+壳聚糖组中油菜苗的鲜质量及叶绿素含量分别较对照组提高了12.03%和19.53%。低温胁迫下，油菜苗的生长受到明显抑制，与对照组相比，低温处理144 h后，油菜苗鲜质量及叶绿素含量分别降低了49.63%和55.42%。与低温胁迫组相比，低温胁迫+壳聚糖组油菜苗鲜质量及叶绿素含量在低温处理144 h后分别提高了37.93%和48.25%。由此可见，壳聚糖能显著缓解低温胁迫对油菜苗的生长抑制。在试验过程中，常温对照条件下油菜苗生长旺盛，叶片鲜绿，而低温条件下组油菜苗出现叶片萎蔫，但低温胁迫+壳聚糖组油菜苗的叶片并未出现萎蔫。

2.2 低温胁迫下，壳聚糖对油菜苗丙二醛含量的影响

研究发现，低温条件下植物细胞内会积累大量的活性氧（ROS），从而对植物细胞造成氧化胁迫。丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的产物，一般可用MDA的浓度反映植物细胞受损伤的程度。如图1所示，在常温条件下，对照组与COS组油菜苗叶片中的MDA含量无显著差异;低温条件下，LT组与LT+COS组油菜苗叶片中的MDA含量急剧增加。低温处理144 h后，LT组油菜苗叶片MDA含量较对照组提高了2.7倍;与对照组相比，LT+COS组油菜苗叶片中的MDA含量同样显著增加，但增加量显著低于LT组。低温处理144 h后，LT+COS组油菜苗叶片中的MDA含量较LT组下降了35.3%。这表明壳聚糖可减轻低温胁迫下油菜苗的细胞损伤。

2.3 低温胁迫下壳聚糖对油菜苗脯氨酸含量的影响

当植物处于胁迫环境中时，其细胞内外的渗透压会出现失衡现象，植物通常会通过积累渗透调节物质来应对胁迫，脯氨酸是一种常见的植物渗透调节物质。从图2可知，在常温环境中，COS组植物叶片中的脯氨酸含量较对照组增加。施加壳聚糖144 h后，COS组油菜苗叶片内的脯氨酸含量是对照组的2.8倍。低温处理后，LT组及LT+COS组油菜苗叶片中的脯氨酸含量显著升高，LT+COS组脯氨酸含量长时显著高于LT组;低温处理144 h后，LT+COS组油菜苗叶片中的脯氨酸含量较LT组要高出62.5%。这表明壳聚糖促进了油菜苗叶片中脯氨酸的积累，且该效果在低温环境中更加明显。

2.4 低温胁迫下壳聚糖对油菜总抗氧化能力的影响

当低温胁迫出现时，植物细胞内会积累大量的活性氧ROS，从而对植物细胞造成氧化胁迫[6]。在研究过程中，本试验对各试验组油菜苗叶片总抗氧化能力（T-AOC）进行了测定。试验结果表明，壳聚糖能显著提升低温环境下油菜苗的总抗氧化能力，如图3所示。

2.5 低温胁迫下，壳聚糖对油菜苗叶片内Ca2+流的影响

在常温环境中，植物细胞质内的自由Ca2+含量非常少，大部分的Ca2+均被固定在液泡内或细胞间质内。当细胞受到来自环境的刺激时，胞质内的自由Ca2+水平会在短时间内迅速提高，从而调控下游靶点的生理变化。如图4所示，与对照组相比，COS组叶片细胞质内的Ca2+表现出明显的波动。在施加COS的前72 h中，細胞质内Ca2+水平显著提高，之后Ca2+含量开始降低并在96 h后回到最初水平。此外，低温胁迫条件下，导致油菜苗叶片胞质内Ca2+水平在处理后的48 h内急剧上升，但LT+COS组中的Ca2+水平在48 h后逐渐开始下降，并在120 h后降低到接近对照组水平。相反地，LT组中Ca2+水平始终保持在较高水平，且显著高于初始水平。

3 结论

本研究采用水培方式，考察了低温条件（4 ℃）下，壳聚糖对油菜苗生长及生理生化的影响，结果表明：在低温胁迫下，与LT组相比LT+COS组油菜苗的鲜质量及叶绿素含量在低温处理144 h后分别提高了37.93%和48.25%;在低温胁迫条件下，壳聚糖对油菜苗叶片细胞的脯氨酸积累和总抗氧化能力有所增强，在一定程度上缓解了低温胁迫引起的MDA增加及叶绿素降解，缓解了低温对油菜苗的损伤。此外，细胞质Ca2+浓度受壳聚糖影响呈波动趋势，这可能是由于壳聚糖通过响应Ca2+信号来调控油菜苗细胞内的生理变化，从而增强其抗低温能力。

参考文献

[1]张洪胜.生物刺激素行业发展概述[J]烟台果树，2016（2）：1-3.

[2]唐银凤.叶绿素含量测定中Arnon公式的系数误差对结果的影响[J].江苏农业科学，1996（3）：48.

[3]Gu-Wen Zhang，Zheng-Lu Liu，Jun-Guo Zhou，et alEffects of Ca（NO3）2 stress on oxidative damage，antioxidant enzymes activities and polyamine contents in roots of grafted and non-grafted tomato plants[J].Plant Growth Regulation，2008（1）：234-235.

[4]J.C. Pinheiro，D.M. Bates. Approximations to the loglikelihood function in the nonlinear mixed effects model[J].Journal of Computational and Graphical Statistics，1995（6）：27.

[5]姜秀梅.外源物质处理对低温胁迫下辣椒种子萌发及幼苗抗冷性的影响[J]新疆农业大学学报，2013（3）：229-233.

[6]张腾国.MAPKK抑制剂对低温胁迫下油菜幼苗光合作用和抗氧化酶活性的影响[J].兰州大学学报（自然科学版），2013（1）：92-99.