申 强,马小玲,胡容峰,贺艳斌,宋丽华

(1 长治医学院药学系药剂学教研室,长治 046000;2 长治市人民医院儿科;3 安徽中医药大学;4 长治医学院药学系化学教研室;5 长治医学院药学系药理学教研室;*通讯作者,E-mail:czmcslh@163.com)

冠状病毒(coronavirus)是具有螺旋对称的衣壳(nucleocapsid)和外套膜(envelope)结构的正向单链RNA病毒[1,2]。众所周知,冠状病毒已成为重要的人类病原体,包括2003年发生在中国的严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和2012年发生在阿拉伯半岛的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)等。2019年发现的冠状病毒是第7种被鉴定出的可引起人类感染的新型冠状病毒(novel coronavirus),被世界卫生组织(WHO)临时命名为2019-nCoV。以上3种病毒均属于β属冠状病毒[3]。进化分析显示,2019-nCoV与SARS-CoV和MERS-CoV的亲缘关系较远,基因序列一致性分别约为79%和50%[4]。大多数冠状病毒引起上呼吸道感染,而SARS-CoV和MERS-CoV及这次的2019-nCoV可引起肺炎、甚至重症肺炎(corona virus disease 2019, COVID-19),且可在人际间传播。鉴于2019-nCoV的高感染率和缺乏有效的治疗方法,迫切需要开发一种针对2019-nCoV的有效抗病毒药物。本文通过对抗2019-nCoV药物作用机制方面的研究进行综述,以期对COVID-19的防治和抗病毒药物的研发提供一些建设性意见。

1 新型冠状病毒肺炎的感染机制

刺突糖蛋白(spike glycoprotein,S蛋白)是病毒侵入细胞的主要介质,也是冠状病毒宿主范围的重要决定因素[5]。例如SARS-CoV的感染是通过S蛋白附着在受体血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)上[6]并随后被宿主细胞蛋白酶,即Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶(transmembrane protease serines, TMPRSS2)裂解而启动的[7-9],然后病毒通过早期和晚期的内体,随后是内体/溶酶体运输。在此期间,宿主蛋白胞外蛋白酶(包括组织蛋白酶L)介导S蛋白在内吞小泡中的进一步切割[10-13],活化的S蛋白将活化病毒和细胞膜融合,并将SARS-CoV的基因组释放到细胞质中。

ACE2是一种跨膜糖蛋白,在人的口鼻黏膜、肺、小肠、肾、胆管等多个组织和器官中均有表达,主要分布在器官组织的内皮细胞和平滑肌细胞上[14,15],研究人员利用分子结构模拟和模型计算的方法,对2019-nCoV的S蛋白和ACE2进行结构对接研究,发现两种蛋白表现出较强的结合能力,表明2019-nCoV可能通过其S蛋白与ACE2结合从而感染人呼吸道上皮细胞[16],此外,中国科学院武汉病毒所石正丽研究员团队[17]分别采用表达ACE2和不表达ACE2的HeLa细胞进行了2019-nCoV感染实验,细胞染色的结果显示2019-nCoV无法进入不表达ACE2的HeLa细胞,但可以进入表达人、中华菊头蝠、麝猫和猪ACE2的HeLa细胞,说明ACE2很可能是2019-nCoV感染细胞的一个重要受体。

2 抗新型冠状病毒肺炎药物作用机制

2.1 氯喹

2020年1月25日,中国科学院武汉病毒研究所与军事科学院军事医学研究院公布的联合研究结果显示:在Vero E6细胞的体外实验中[18],磷酸氯喹(chloroquine phosphate)的IC50抑制为1. 13 μmol/L,即0.58 μg/ml,说明在细胞水平上磷酸氯喹能有效抑制2019-nCoV的细胞进入。截止2月15日,中国正在十多家医院开展氯喹临床研究,累计入组患者超过100例。临床结果初步显示,磷酸氯喹对COVID-19有一定的治疗效果[18]。在2月19日国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》中,抗病毒治疗部分删除“目前没有确认有效的抗新型冠状病毒治疗方法。”在试用药物中,增加了“磷酸氯喹(成人每次500 mg,每日2次)和阿比多尔(成人每次200 mg,每日3次)”等药物[19]。

作为一款“老药新用”的抗疟疾药,氯喹同时具有广谱抗病毒、免疫调节的作用。与瑞德西韦(remdesivir)不同,因为其上市时间已久,无专利限制,在中国有多家药企具备生产与销售资质,可快速满足临床需求,且便于生产和存储,药物可及性更高,其毒副作用比洛匹那韦(lopinavir)、利托那韦(ritonavir)等抗HIV药物更小,作为应急药物具有多重优势,加之临床效果明确,成为疫情防控与患者治疗“新的希望”。

氯喹的抗2019-nCoV的4种可能机制:①氯喹可通过干扰冠状病毒受体蛋白ACE2的末端糖基化来削弱病毒与人体细胞受体的结合,抑制病毒的细胞侵入[20]。②氯喹化学结构中的多个碱性基团,可提高病毒与细胞融合所需的内体的pH值,能阻断冠状病毒、逆转录病毒等pH依赖性病毒的复制[21]。③氯喹具有免疫调节作用,可减少免疫病理性损伤。氯喹可抑制TNF-α和IL-6的产生和释放,在2019-nCoV感染的中后期,TNF-α和IL-6浓度和疾病的严重性相关,因此氯喹的抗炎作用也可减少免疫病理性损伤[22]。④氯喹通过与病毒蛋白水解酶PLpro(papain-like protease)结合,抑制冠状病毒的转录和翻译过程,从而抑制病毒传播、达到治疗效果。另有两种文献中的氯喹机制,包括影响ACE2在细胞表面上的表达,以及干扰病毒S蛋白的合成过程,已在实验中被排除[23]。

目前氯喹作用于冠状病毒的具体机制还没有充分的实验数据支撑。分子对接和动力学模拟显示氯喹可以稳定结合于尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺-2-表异位酶(UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase,GNE)的别构位点,GNE在唾液酸(sialic acid)的生物合成中发挥关键作用,而唾液酸参与SARS-CoV表面受体ACE2的糖基化过程,因此氯喹可能通过抑制GNE对唾液酸的合成来影响ACE2糖基化,从而发挥抗2019-nCoV病毒的作用;同时氯喹也可以稳定地与PLpro结合,抑制病毒的转录与复制,实现治疗效果[16,24-27]。

2.2 阿比多尔

阿比多尔是前苏联研制的一种光谱抗病毒非处方(OTC)药物,毒性较低(LD50>4 g/kg),可用于防治流感,也可用于防治SARS(IC50为5.26 μg/ml)和MERS冠状病毒[28-30]、鼻病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等其他引起急性呼吸道病毒感染的病毒。2020年2月4日,李兰娟院士团队公布了阿比多尔体外细胞实验结果:阿比多尔在10-30 μmol/L浓度下,与药物未处理的对照组比较,能有效抑制2019-nCoV达到60倍,并且显著抑制病毒对细胞的病变效应。但目前阿比多尔(abidor)抗2019-nCoV的作用机制尚不十分清楚。

已知的阿比多尔抗病毒作用机制:①阻止病毒入胞:阿比多尔通过干扰网格蛋白依赖型内吞作用来抑制病毒进入[31];阿比多尔抑制病毒脂膜-内体泡膜的融合,发挥膜融合抑制作用[32]。②诱生干扰素:阿比多尔通过激活2,5-寡聚腺苷酸合成酶(OAS),诱导干扰素生成,降解病毒mRNA,阻止病毒复制。其具有强烈的诱生干扰素作用,可在较短时间(24 h)诱导呼吸道局部黏膜产生足量干扰素,并于第4天在呼吸道局部形成广谱抗病毒状态。提高机体免疫功能和吞噬病毒的能力,比注射疫苗产生作用的时间(一般为14 d)更快[33]。③提高机体免疫:阿比多尔可激活吞噬细胞,增强非特异性免疫[34]。阿比多尔对免疫低下患者的多项免疫学参数(CD4+、CD8+、B细胞及血清免疫球蛋白)均有明显的改善作用[35]。

阿比多尔用于治疗流感10余年,目前尚无耐药报道,未在人群中发现耐药株,可见阿比多尔与单靶点抗病毒药不同,有多种抗病毒的机制。但这些都还有待研究。

2.3 利巴韦林

利巴韦林(ribavirin,病毒唑)是具有广谱抗病毒作用的嘌呤核苷类似物,可能具有多种作用机制,包括致死性诱变、专性或非专性链终止、以及通过抑制肌苷酸-5-磷酸脱氢酶的合成(其靶点为RdRp),阻断肌苷酸转化为鸟苷酸,从而阻止RNA和DNA病毒的复制,这条反应链的最后一步是RNA基因突变最致命最关键的一步[36]。因此利巴韦林在临床上具有良好的抗病毒作用,对DNA病毒和RNA病毒均有抑制复制作用。在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》中,推荐使用利巴韦林(建议与干扰素或洛匹那韦/利托那韦联合应用,成人500 mg/次,每日2-3次静脉输注)[19]。

2.4 洛匹那韦/利托那韦

洛匹那韦是人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)蛋白酶抑制剂,常与利托那韦联用,通过利托那韦抑制细胞色素P450酶代谢来增加洛匹那韦半衰期。体外实验结果显示,洛匹那韦/利托那韦能够一定程度抑制冠状病毒复制[37]。我国学者利用绒猴动物模型发现,洛匹那韦/利托那韦和干扰素-β联用治疗MERS-CoV感染,比对照组疗效更好[37]。该药在2019-nCoV感染患者中的疗效和安全性的临床随机对照研究(ChiCTR2000029308)目前正在进行中。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》中建议的给药方案是洛匹那韦/利托那韦(成人400 mg/100 mg,每日2次)[19]。

2.5 氨溴索

氨溴素(ambroxol,沐舒坦)系黏液溶解剂,作为一种已在临床应用许久的药物,安全性较高,其不仅具有化痰、排痰作用,氨溴素大剂量使用还可刺激呼吸道Ⅱ型肺泡细胞合成和分泌肺泡表面活性物质,还具有抗氧化、抗炎作用,且其可预防和治疗肺纤维化。尤其是氨溴索作为潜在的ACE2受体结合剂之一[38],对2019-nCoV的预防或减轻其造成急性肺损伤甚至急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),以及减缓肾脏及心脏损伤,提供了有益的治疗思路。因此氨溴素也被推荐为治疗COVID-19用药之一。

氨溴索防治COVID-19的3种可能机制:①氨溴素可促Ⅱ型肺泡细胞合成和分泌肺泡表面活性物质。表达ACE2的Ⅱ型肺泡很可能是2019-nCoV感染的靶细胞,而氨溴素刺激呼吸道Ⅱ型肺泡细胞合成和分泌肺泡表面活性物质的作用,可防止肺部炎症损伤、维持肺泡结构[38],对2019-nCoV所致ARDS起重要防治作用。且研究显示,当机体出现ARDS时,肺泡巨噬细胞、粒细胞、单核细胞被激活,肺内源性氧化剂的产生增加,因此产生大量的氧自由基,而氨溴索则可以通过抑制超氧化物阴离子、过氧化氢的生成,来减轻氧化应激损伤。②氨溴索有抗肺纤维化作用。氨溴素可以抑制细胞因子及花生四烯酸产物的生成,减轻中性粒细胞和巨噬细胞的释放和聚集,起到抗炎作用,从而减缓肺部纤维化进程[39]。③作为可能的ACE2结合剂,氨溴索可抑制病毒刺突S蛋白与细胞ACE2受体的结合,从而抑制2019-nCoV的细胞侵入[38]。

2.6 瑞德西韦

美国第1例COVID-19患者在接受了瑞德西韦的药物静脉输注后,体温迅速恢复正常,呼吸困难症状明显减轻,不再需要吸氧,只剩少许干咳和流鼻涕症状[40],该论文发表时,该患者虽仍在住院观察,但症状已经明显好转。瑞德西韦是由吉利德公司开发的一种核苷类似物,主要是作为抗埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)和马尔堡病毒(Marburg virus)的试验药物,目前在体外和体内动物模型试验中对MERS-CoV和SARS-CoV均具有抗病毒活性[41],对于同为冠状病毒的2019-nCoV,最近的研究也表明瑞德西韦在体外实验中展现出抑制活性,IC50值为0.77 μmol/L[18]。目前,瑞德西韦还未通过完整的临床试验,尚未在任何国家获得批准上市,其在人体内的实际效果和安全性仍有待评估。2月5日,中日友好医院与武汉市金银潭医院启动了瑞德西韦治疗新型冠状病毒感染的双盲试验临床研究,被纳入临床试验的患者共计761例其中轻、中症患者共计308例,重症患者453例。

冠状病毒因3′-5′核酸外切酶特性使得多种核苷类似物无有效抗病毒活性,而瑞德西韦通过完整的核糖核酸外切酶校对可有效地抑制冠状病毒,其三磷酸化后的产物与三磷酸腺苷(ATP)竞争抑制RNA聚合酶(RNA-derived RNA polymerase,RdRp)的活性,特别是呼吸道合胞病毒(RSV)聚合酶的的活性,在人体多种细胞中代谢合成具有活性的核苷三磷酸(NTP),NTP作为替代底物,通过与新生病毒的RNA链结合,致使病毒早熟而终止[42,43]。

2.7 替考拉宁

替考拉宁(teicoplanin)是一种糖肽类抗生素,研究发现其可显著抑制埃博拉病毒、SARS-CoV、MERS-CoV和2019-nCoV假病毒的细胞进入[44,45]。进一步的机制研究表明,替考拉宁可通过特异性抑制组织蛋白酶L的活性来阻断病毒的进入,可作为组织蛋白酶L依赖性病毒的潜在抑制剂。这为2019-nCoV感染的防治提供了可能的策略。

此外,该研究[45]在体外实验中还发现包括替考拉宁和达巴万星(dalbavancin)在内的几种糖肽类抗生素对组织蛋白酶L表现出特异性抑制作用,达巴万星以剂量依赖性方式抑制2019-nCoV的细胞进入。但是,另一种常用抗生素万古霉素并没有抑制2019-nCoV的进入,结果与先前几种糖肽类抗生素对SARS-CoV和MERS-CoV的抑制作用一致。

替考拉宁血浆半衰期长,给药方便,主要用于由革兰氏阳性细菌(如金黄色葡萄球菌和链球菌)引起的严重感染。临床上用于抑制革兰氏阳性菌的替考拉宁的推荐血浆浓度为15 mg/L,即8.78 μmol/L,常用剂量为400 mg/d。该研究发现其对2019-nCoV的IC50抑制仅为1.66 μmol/L,这远低于常规临床药物浓度。因此,常规剂量(400 mg/d)可考虑用于2019-nCoV感染的患者。如果效果不明显,则由于毒性低,可以优化剂量。可以考虑使用800 mg/d或1 200 mg/d的剂量来提高药物效率。鉴于抗病毒治疗的原则是尽早预防病毒感染和扩增,因此该研究建议在早期就将替考拉宁用于COVID-19。或者它可以代替万古霉素或其他抗生素在适当的时候治疗革兰氏阳性细菌的合并感染。因此,替考拉宁可作为2019-nCoV感染和与革兰氏阳性细菌共感染的双重抑制剂。

3 新型冠状病毒肺炎的中医药治疗

中医认为新冠肺炎为“寒湿疫”,国家卫健委和中医药管理局推荐在中西医结合救治新冠肺炎中使用“清肺排毒汤”[19]。清肺排毒汤来源于汉代张仲景所著《伤寒杂病论》中的多个治疗由寒邪引起的外感热病的经典方剂组合,是仲景相关经方融合创新运用。此方为麻杏石甘汤、射干麻黄汤、小柴胡汤、五苓散巧妙相合,性味平和。可用于治疗2019-nCoV感染的肺炎轻型、普通型、重型患者,在危重症患者救治中也可结合患者实际情况合理使用。该方也可用于普通感冒和流感患者。“肺炎中医药有效方剂筛选研究”专项在山西、河北、黑龙江、陕西四省试点开展清肺排毒汤救治新型冠状病毒感染的肺炎患者临床疗效观察,据统计,截至2020年2月5日,4个试点省份运用清肺排毒汤救治确诊病例214例,3 d为一个疗程,总有效率达90%以上,其中60%以上患者症状和影像学表现改善明显,30%患者症状平稳且无加重。

现将“清肺排毒汤”从中医理论“复方”角度作一分析:清肺排毒汤既祛寒闭又利小便祛湿,麻黄可增五苓散祛湿,五苓散控制麻桂发汗之峻,桂枝甘草辛甘化阳扶正,苓桂术甘又有健脾化饮之用,因新冠肺炎胸憋气短,虽无明显喘,其实肺闭不宣,比有喘咳更为严重,又合用射干麻黄汤及橘枳姜汤,小柴胡汤为少阳病,半表半里,又可通利三焦,既防疫邪入里,又调肝和胃,顾护消化功能,加藿香为芳香化湿,用石膏防郁而化热。

4 回顾与展望

综上,目前关于2019-nCoV病毒的研究还不十分清楚,对于相关药物的作用机制和治疗效果也有待进一步深入研究和考证。但是利用分子对接结合自由能计算和深度学习模型等计算机模拟技术,已经找到了一些针对2019-nCoV的潜在抑制剂。通过分析文献可以看出,以2019-nCoV上高度保守复制的基因序列为基础,针对S蛋白和ACE2受体,或RNA切割和复制的主要蛋白酶(Mpro),TMPRSS2,组织蛋白酶L,糜蛋白酶样蛋白酶(3CLpro),类木瓜蛋白酶(PLpro)和RdRp等为靶点开发抗病毒药物可能是未来研究的方向。在此基础上,积极开展体外细胞实验,动物模型实验以及药物临床试验。

鉴于炎症组织的低pH特性和病毒复制的pH依赖性,未来可以在酸响应性靶向纳米给药系统,肺泡表面活性物质类似物等方面开展药学研究,以提高抗2019-nCoV药物的靶向性和生物利用度,进一步促进对COVID-19感染的有效治疗。