周 芳,唐成芳,曾 辉,李子夏,郭 芳

(1 西安医学院口腔医学院口腔正畸学教研室,西安 710021;2 西安医学院口腔医学院口腔修复学教研室;3 西安医学院口腔医学院口腔内科学教研室;4 西安医学院口腔医学院口腔外科学教研室;*通讯作者,E-mail:39068416@qq.com)

牙周病是引起患者牙齿缺失的首要病因[1],牙周病患者牙槽骨骨微结构破坏,不但影响咀嚼功能,还会加速牙槽骨骨量丢失[2],目前全世界有8%-30%的中年人为牙周病患者[3],牙周病的治疗已经成为口腔医学研究的难点和重点。正畸治疗是牙周病综合治疗的主要方法[4],有学者认为正畸治疗可以解除牙周病的致病因素[5],也有报道称牙周病患者在正畸治疗过程中会出现牙齿松动、牙槽骨形态异常的情况[6-8]。本研究建立牙周病及静止期牙周病动物模型并对其牙齿加力,观察牙齿移动对动物模型牙槽骨骨微结构及炎症反应的影响,为牙周病患者的治疗提供更多治疗依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

28周龄SD雄性大鼠72只,平均体质量(330±51.7)g,购自空军军医大学动物中心,实验动物生产许可证号:SCXK(陕)2014-002,实验动物使用许可证号:SCXK(陕)2014-001。

1.2 主要仪器和试剂

Bruker Skyscan Micro-CT系统(型号:1176),NIKON Eclipse ci显微镜。EDTA抗原修复液、柠檬酸抗原修复液、PBS缓冲液、自发荧光淬灭剂、BSA、一抗、荧光二抗、DAPI,均由Servicebio公司提供。

1.3 动物模型建立及分组

大鼠随机分为对照组(24只)和实验组(48只)。对照组不作处理。实验组大鼠结扎下颌双侧第一磨牙牙颈部,6周后见牙龈肿胀,呈暗红色,探诊出血明显,牙周纤维排列紊乱,大量炎性细胞浸润,牙槽骨可见破骨细胞及大量骨吸收陷窝。

去除实验组大鼠结扎丝,随机对实验组半数大鼠行牙周基础治疗(24只),4周后见治疗牙齿牙龈萎缩,探诊不出血,探诊深度较治疗前减小,牙周组织少量炎症细胞侵润,牙槽骨遗留少量骨吸收陷窝,胶原纤维修复[9]。实验组其余大鼠不做处理。

以下颌第一磨牙为观察对象,近中移动所有实验组大鼠下颌右侧第一磨牙,力值50 g。将实验组分为静止期牙周病组(牙周治疗大鼠左侧)、静止期牙周病加力组(牙周治疗大鼠右侧)、牙周病组(其余实验组大鼠左侧)、牙周病加力组(其余实验组大鼠右侧)。各组于加力0,7,14,21 d,取双侧下颌骨行micro-CT扫描、免疫荧光染色。

1.4 Micro-CT扫描方式

Bruker Skyscan Micro-CT系统扫描,电压80 kV,电流310 μA,分辨率18 μm,扫描结束后采用CTvox3.3软件对所获影像行三维重建。 选取动物模型双侧下颌第一磨牙近中根近中牙槽嵴边缘至远中根远中牙槽嵴边缘为感兴趣区域(region of interest,ROI),Data Viewer1.5.6软件测量感兴趣区域内骨密度(bone mineral density,BMD),骨体积分数(bone volume fraction,BV/TV),骨小梁数量(trabecular bone number,Tb·N),骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb·Th)和骨小梁分离距离(trabecular bone separation distance,Tb·Sp)[10]。

1.5 免疫荧光染色

标本脱钙、脱水、包埋、切片、脱蜡、免疫荧光染色。细胞核在紫外光下为蓝色,IL-6特异性染色为细胞膜呈红色。应用Image-Pro Plus6.0软件将红色荧光单色照片转换为黑白图片后选取相同的黑色作为判断阳性的统一标准,计算平均光密度值(average optical, AO)=累积光密度值(increase optical density,IOD)/组织像素面积(AREA),AO越大表示阳性表达越高(见图1)。

A.DAPI×400,细胞核蓝染 B.图A、C merge图×400 C.IL-6×400,细胞膜红染 D.图C转换为黑白图片图1 AO的计算方式Figure 1 Calculation method of average optical

1.6 统计学分析

采用Graphpad prism8.0.2软件处理数据,多样本间的比较采用单因素方差分析,各组方差齐性时, 采用LSD-t检验,方差不齐时,采用Tamhane’T2法检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 牙槽骨骨微结构

加力0,7,14,21 d,牙周病组、牙周病加力组、静止期牙周病组和静止期牙周病加力组BMD、BV/TV、Tb·Th均低于对照组(P<0.05),Tb·N、Tb·Sp高于对照组(P<0.05)。加力0,7,14,21 d,静止期牙周病组BMD和Tb·Th均高于牙周病组,Tb·Sp低于牙周病组(P<0.05);加力14 d和21 d,静止期牙周病组Tb·N低于牙周病组(P<0.05,见表1-5)。加力0,7,14,21 d,静止期牙周病加力组BMD、BV/TV、Tb·Th均高于牙周病加力组(P<0.05),Tb·Sp低于牙周病加力组(P<0.05);加力14 d和21 d,静止期牙周病加力组Tb·N低于牙周病加力组(P<0.05,见表1-5)。

牙周病组和牙周病加力组BMD、BV/TV、Tb·Th随加力时间逐渐降低,Tb·N、Tb·Sp逐渐升高;静止期牙周病组骨微结构各项指标无明显变化;静止期牙周病加力组BMD、BV/TV在加力14 d时降至最低,Tb·N、Tb·Sp升至最高(见表1-5、图2)。

表1 各组BMD的差异Table 1 Comparison of BMD among five

表2 各组BV/TV的差异Table 2 Comparison of BV/TV among five

表3 各组Tb·N的差异Table 3 Comparison of Tb·N among five

表4 各组Tb·Th的差异Table 4 Comparison of Tb·Th among five

表5 各组Tb·Sp的差异Table 5 Comparison of Tb·Sp among five

A.加力0 d B.加力7 d C.加力14 d D.加力21 d图2 静止期牙周病加力组micro-CTFigure 2 Micro-CT of the mandible bones in quiescent periodontitis with force group

2.2 IL-6的表达

相同加力时间下,牙周病组、牙周病加力组、静止期牙周病组、静止期牙周病加力组AO均高于对照组(P<0.05);加力7 d和14 d,牙周病加力组AO高于牙周病组(P<0.05);加力7,14,21 d,静止期牙周病加力组AO高于静止期牙周病组(P<0.05),加力0,7,21 d,牙周病加力组AO高于静止期牙周病加力组(P<0.05,见表6)。

牙周病组AO随加力时间逐渐升高,牙周病加力组AO在加力7 d升至最高,静止期牙周病组AO无明显变化;静止期牙周病加力组AO在加力14 d升至最高(见表6、图3)。

表6 各组AO的差异Table 6 Comparison of AO among five

A.加力0 d B.加力7 d C.加力14 d D.加力21 d图3 静止期牙周病加力组IL-6的表达Figure 3 IL-6 expression in quiescent periodontitis with force group

3 讨论

牙周病患者的牙周支持组织被破坏,且骨吸收活跃[11],常导致牙齿移位,影响功能和美观,相比常规的牙周基础治疗,牙周-正畸联合治疗可以控制牙周炎症,排齐牙列,改善咀嚼功能及外观,解除咬合创伤,有利于牙周组织的恢复。但是有学者发现部分牙周病患者在正畸治疗中牙周炎症被激活,出现了牙槽骨加速吸收的情况[12,13],因此,对牙周病患者正畸治疗过程中牙槽骨的变化及其影响因素的研究具有重要的临床意义。

micro-CT的检测指标中,BMD可以反映骨骼的质量和强度,BV/TV可以反应骨骼代谢情况,Tb·N、Tb·Sp、Tb·Th决定骨骼的强度[10]。本研究发现,加力0 d,牙周病组和牙周病加力组BMD、BV/TV、Tb·Th分别较静止期牙周病组和静止期牙周病加力组降低,Tb·N、Tb·Sp升高,而且在相同加力时间下,牙周病加力组BMD、BV/TV、Tb·Th较静止期牙周病加力组降低,Tb·N、Tb·Sp升高。说明经过牙周基础治疗,静止期牙周病动物模型牙槽骨骨微结构有一定的恢复,而且牙齿移动后,静止期牙周病动物模型牙槽骨的破坏程度相较牙周病动物模型减轻。以往有学者发现牙周病大鼠牙槽骨改建的最活跃时期为加力后的第7天[14],本研究发现,牙周病加力组BMD、BV/TV、Tb·Th随加力时间逐渐降低,Tb·N、Tb·Sp逐渐升高,而静止期牙周病加力组BMD、BV/TV在加力14 d时降至最低,Tb·N、Tb·Sp升至最高。说明牙齿移动后,牙周病动物模型牙槽骨吸收持续存在,而静止期牙周病动物模型牙槽骨在加力14 d骨吸收最活跃,骨强度最低,这可能是由于牙周组织的状态不同导致对正畸力的敏感性有所差别。当力学刺激超过牙周组织相关骨改建细胞反应的“阈值”下限时,细胞才会应答[15],由此可见,静止期牙周病动物模型牙周组织中相关骨改建细胞对力学刺激反应的“阈值”升高,使得骨改建变得缓慢。

目前的研究认为牙齿移动实质是牙周组织的炎性反应,牙周膜在应力作用下分泌并表达多种生长因子,调控牙槽骨的沉积和吸收,从而使牙齿移动到新的位置。与牙周炎症和正畸牙齿移动骨改建相关的细胞因子较多,白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)与牙齿移动骨代谢密切相关,在牙周病的发生发展及正畸牙齿移动中起着重要作用,被认为是骨吸收的标志物之一[16,17],而且其表达量与牙周炎症严重程度呈正相关,可以作为表示牙周破坏程度的指标[18]。本研究中,相同加力时间下,牙周病加力组、静止期牙周病加力组AO均高于对照组;加力0,7,21 d,牙周病加力组AO均高于静止期牙周病加力组。说明牙齿移动后,静止期牙周病动物模型确实出现了牙周炎症加重的情况,但牙周破坏程度较牙周病动物模型减轻。

综上所述,静止期牙周病动物模型牙槽骨骨微结构有一定恢复,牙齿移动初期也会出现牙周炎症加重,骨强度下降的现象,并且在加力14 d时牙槽骨吸收最活跃,但在整个牙齿移动过程中牙周组织的破坏程度较牙周病动物模型减轻。