陈树钊，黄文河，李瑶琛

(1.汕头大学医学院附属肿瘤医院中心实验室，广东 汕头 515041；2.厦门大学附属翔安医院乳甲外科，福建 厦门 361101)

乳腺癌是当今女性发病率最高的癌症[1]，近几十年来，我国乳腺癌的发病率一直在上升[2]，迫切需要更有效的诊断方法，以便在早期诊断和治疗乳腺癌。微小RNA(microRNA，miR)是一类小型非编码内源性RNA 分子，长度约为22 个核苷酸，从基因组DNA 转录成为长的初级转录物pri-miRNA，然后由RNase Ⅲ型Drosha和Dicer酶修饰以产生pre-miRNA和miRNA，通过与靶mRNA的3′端非翻译区(3′-untranslated regions，3′-UTR)部分互补结合，参与基因表达的转录后调控[3]。miR-199a通过靶向癌基因或肿瘤抑制因子或同时靶向两者，直接或间接参与多种癌症的发展。在乳腺癌中，miR-199a不仅与肿瘤的发生、进展及预后有关，而且还调节肿瘤对化疗、放疗的敏感性。本文就miR-199a在乳腺癌中的研究进展作一综述。

1 miR-199a在乳腺癌中的表达

Wang 等[4]通过研究68 例乳腺癌患者和40 例健康患者的乳腺组织及血清样本，发现乳腺癌患者组织和血清的miR-199a 水平明显下调。Shin 等[5]使用微阵列芯片分析平台，发现miR-199a-5p在乳腺癌组织中的表达低于正常乳腺组织。而Zhang 等[6]利用血清直接多重qRT-PCR 对128个血清标本进行检测，发现乳腺癌患者的血清miR-199a相对表达量是健康对照组的2.65 倍。Bockmeyer 等[7]利用TaqMan 低密度芯片分析了664 种microRNA，聚类分析发现，与乳腺正常管腔细胞相比，正常基底细胞中的miR-199a-3p显著上调。与管腔A型、B型和基底样型这3种乳腺癌亚型相比，乳腺恶性肌上皮瘤中的miR-199a-3p表达水平明显上调，这表明正常乳腺基底细胞的microRNA 表型可能与乳腺恶性肌上皮瘤密切相关。此外，研究人员也通过确定正常乳腺上皮基底和管腔细胞中的microRNA 表达模式，发现该表达模式与不同乳腺癌亚型有一定的关系，这将助于人们更好地理解各种乳腺癌亚型的分化谱系和恶性转化。Carter 等[8]研究发现产后乳腺癌早期组(产后诊断乳腺癌时间≤5.2 年)患者与晚期组(产后诊断乳腺癌时间≥5.3年)相比，miR-199a-5p的表达水平有所下调。

2 miR-199a的靶基因

miR-199a在肿瘤的增殖、侵袭、转移和血管生成等生物学过程中发挥着重要作用，这与miR-199a 的靶基因功能密切相关。目前为止，在乳腺癌中已经发现的miR-199a下游靶基因有V-ets 成红细胞增多症病毒E26 癌基因同源物 1(erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1，Ets-1)、盘状结构域受体1(discoidin domain receptor 1，DDR1)、Caveolin-2、核受体共阻遏因子(nuclear receptor corepressor，LCOR)、多药耐药蛋白1(multidrug resistance protein 1，MRP1)、线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)、受体酪氨酸激酶Axl、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4(serine/threonine protein kinase 4，PAK4)等。

2.1 Ets-1

Ets-1 是红细胞增多症病毒E26 癌基因转录因子家族一员，Ets-1与雌激素受体α、核受体辅激活物共同协作促进了乳腺癌细胞的增殖[9]。Li等[10]通过免疫组织化学染色法发现乳腺癌组织中Ets-1 蛋白的表达与miR-199a-5p 的水平呈负相关，继而在双荧光素酶实验中证实了miR-199a-5p 通过与Ets-1基因的 3′-UTR 序列作用，下调了 Ets-1 的活性。随着Ets-1基因的敲除，β1整合素的水平下降，并降低了乳腺癌细胞MDA-MB-231 和MCF-7 的体外迁移和侵袭能力，这意味着miR-199a-5p/Ets-1/β1整合素信号轴抑制了乳腺癌肿瘤的进展。

2.2 DDR1

胰岛素样生长因子Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)是一种保守的分泌蛋白，影响哺乳动物的发育和代谢[11]。DDR1 是一种胶原蛋白受体酪氨酸激酶，是乳腺癌细胞中，IGF-Ⅰ受体的重要靶标[12]。Roberta 等[13]发现，随着IGF-Ⅰ处理乳腺癌细胞MCF-7 和MDA-MB-231 时间的延长或IGF-Ⅰ剂量的增加，DDR1蛋白明显上调，miR-199a-5p 下调。在 MCF-7 细胞中，IGF-Ⅰ诱导 DDR1 蛋白上调的进程可以完全被磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase，PI3K)和蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)抑制剂所阻断。双荧光素酶报告实验验证了 miR-199a-5p 可以靶向 DDR1 的 3′UTR。myr-PKB 转染MCF-7 和 MDA-MB-231 细 胞 后 ， miR-199a-5p 下 调 ，DDR1 上调。这些结果提示IGF 可能通过激活PI3K/PKB/miR-199a-5p 途径导致DDR1 表达增加。对于过表达IGF-Ⅰ的乳腺癌细胞，通过调控PI3K/PKB/miR-199a-5p/DDR1信号轴有可能成为一种重要的乳腺癌治疗途径。

2.3 Caveolin-2

Caveolin-2 是细胞膜穴样凹陷的结构蛋白。Shatseva等[14]通过细胞增殖实验发现miR-199a-3p 可以增加内皮细胞和乳腺癌细胞的增殖能力，通过生物信息学筛选发现Caveolin-2 的 3′UTR 中存在 miR-199a-3p 的 2 个潜在靶位点，在随后进行的荧光素酶实验中证实了Caveolin-2基因是miR-199a-3p 的靶基因。进一步发现在MDA-MB-231细胞中过表达Caveolin-2 后，可削弱miR-199a-3p 的促乳腺癌细胞增殖活性，提示miR-199a-3p 靶向Caveolin-2 可能在乳腺癌进展中起重要作用。

2.4 TFAM

TFAM 对维持线粒体的生物合成及功能至关重要，参与肿瘤的发生和进展。TFAM 可以促进乳腺癌细胞增殖，降低雌激素受体阳性乳腺癌对顺铂化疗的敏感性[15]。Fan等[16]通过荧光素酶实验证明了TFAM基因是miR-199a的靶基因，在对顺铂(DDP)耐药型MDA-MB-231(MDA-MB-231/DDP)细胞中，TFAM 过表达可减弱miR-199a-3p 过表达诱导的耐药性。这些结果表明miR-199a-3p可能通过抑制TFAM的表达来减弱乳腺癌细胞对顺铂的耐药性。

2.5 Axl

受体酪氨酸激酶Axl 可以通过结合生长因子将信号从细胞外基质转导到细胞质中，有助于癌细胞的免疫逃逸和耐药性，增强肿瘤侵袭和转移能力[17]。Mudduluru等[18]利用生物信息学预测Axl可能受到miR-34a/miR-199a调控，将miR-34a 或 miR-199a 转染 MDA-MB-231 细胞，这 2 种miRNA 在转录水平上共同竞争调节Axl。细胞侵袭和划痕实验显示，miR-34a 和miR-199 显著降低癌细胞的迁移和侵袭，甲基化特异性PCR 揭示了miR-34a、miR-199a 和Axl 启动子在乳腺癌细胞中高甲基化，说明在癌症中表观遗传修饰调控miRNA可能是一种普遍现象。

2.6 PAK4

Li 等[19]在 MDA-MB-231 细胞中过表达 miR-199a-3p后，抑制了细胞的生长、迁移和侵袭，而敲除PAK4基因则得到相反的结果。通过生物信息学分析和荧光素酶实验验证了PAK4是miR-199a-3p 的靶基因，随着miR-199a-3p 的上调，磷酸化ERK、MEK 的表达下降，提示了miR-199a-3p通过抑制PAK4/MEK/ERK通路起到抗肿瘤作用。

2.7 LCOR

Celià-Terrassa 等[20]通过荧光素酶实验证实了 LCOR 是miR-199a 的下游效应物，通过生物信息学分析发现miR-199a/LCOR 抑制了α干扰素的应答基因转录，由于癌症干细胞对干扰素的反应较弱，可以逃避免疫监视[21]。因此，若通过靶向miR-199a-LCOR 轴，乳腺癌癌症干细胞可以对干扰素应答更敏感，进而削弱自身的免疫特权。

3 miR-199a与临床病理特征的关系

Shin等[5]收集了5名三阴性乳腺癌患者的血清，采用受试者操作特征曲线分析发现miR-199a-5p 的表达水平越高，肿瘤的分期越低。ER/PR(+)和HER2(+)的肿瘤细胞中，miR-199a-5p的表达高于三阴性乳腺癌。Zhang等[6]收集了128 个血清样本，发现乳腺癌患者miR-199a、miR-29c 和miR-424 的表达水平比健康对照组高，miR-199a、miR-29c和miR-424这3种microRNA 组合在一起区分乳腺癌患者与健康人群方面具有较高诊断准确性(AUC=0.888)。但这种miRNA 组合与临床病理特征(如ER、PR、HER2)的相关性不显著，Verderio等[22]认为可能是未结合上述3种microRNA的综合评分从而造成了误差，建议使用多变量分析方法分析。Celià-Terrassa等[20]通过Buffa数据集发现miR-199a-5p 高表达的ER(-)乳腺癌患者的无远处复发生存率低于miR-199a-5p低表达患者。Jiang等[23]通过研究三阴性乳腺癌特异性数据集发现miR-199a-5p是三阴性乳腺癌的独立预后标志物。miR-199a的表达与乳腺癌患者临床预后、病理特征的关系仍未完全明确。

4 miR-199a对乳腺癌化疗和放疗敏感性的影响

Chang 等[24]发现linc00518 的敲除增强了耐药型MCF-7细胞(MCF-7/ADR)对阿霉素，长春新碱和紫杉醇的化学敏感性，miR-199a 的下调可逆转这种效应。Fan 等[16]发现MDA-MB-231 和 MDA-MB-231/DDP 细 胞 中 ， miR-199a-3p 的表达水平明显下调，过表达miR-199a-3p 可以增加MDA-MB-231/DDP细胞对DDP的敏感性。Shatseva等[14]分别对乳腺癌MT1细胞的miR-199a-3p进行过表达和抑制生成的处理，经多烯紫杉醇处理后，发现miR-199a-3p过表达后产生的凋亡细胞比例更高。这些研究表明miR-199a对提高乳腺癌化疗药物敏感性起到重要作用。

易贺庆等[25]分别在MDA-MB-231 细胞和MCF-7 细胞内过表达miR-199a-5p，并给予电离辐射处理，发现与未过表达miR-199a-5p 的对照组相比，过表达miR-199a-5p的MDA-MB-231 细胞的增殖活性降低至90%，MCF-7 细胞则无明显变化。通过荧光素酶实验发现，在MDA-MB-231 细胞中，miR-199a-5p 与DRAM1和BECN1R基因结合并上调其表达，从而激活自噬过程，并且增强电离辐射诱导的自噬；在MCF-7细胞内，miR-199a-5p下调了DRAM1和BECN1R基因的表达，抑制了电离辐射诱导的自噬。这提示了miRNA自噬调控网络在乳腺癌放疗过程中起重要作用，在不同细胞背景下，miRNA对靶基因及生物功能的调控机制又有所区别。

5 小结

miR-199a在转录后水平调控抑癌基因或促癌基因的表达，在乳腺癌细胞的增殖、凋亡、转移和侵袭等过程中起到重要作用，进而影响了癌细胞的临床病理特征和预后，也影响化疗、放疗的敏感性。随着对miR-199a 的深入研究，发现由于其靶基因作用的不同，miR-199a在乳腺癌中发挥着促癌或抑癌的双重角色，其靶基因具体信号传导机制和功能仍需进一步地深入探索。miR-199a能否成为乳腺癌早期筛选指标和靶向治疗靶点尚需继续研究。