曹满雄，江迦典，洪佳琼，陈芾珩

(汕头大学医学院第一附属医院血液内科，广东 汕头 515041)

血小板无力症是一常染色体隐性遗传性疾病，主要是由于血小板膜糖蛋白Ⅱb(glycoproteinⅡb，GPⅡb)和(或)糖蛋白Ⅲa(glycoprotein Ⅲa，GPⅢa)的质或量的异常导致[1]。GPⅡb 和 GPⅢa 分别由血小板整合素α2b 亚单位(integrin subunit α2b，ITGA2B)和整合素β3 亚单位(integrin subunit β3，ITGB3)基因编码。人ITGA2B和ITGB3基因均位于17号染色体上，分别由30个外显子和15个外显子组成[2]，二者可发生缺失突变[3]、插入突变[4]、碱基置换突变[5]、剪接突变[6]等。致病性的变异可通过影响GPⅡb/Ⅲa 的生物合成、转运及功能，进而影响血小板的聚集功能[7]。

随着测序技术广泛应用，发现新突变的可能性变得更大。构建细胞或小鼠疾病模型等进行致病性分析成本昂贵，且体内与体外实验或种属之间存在差异，使这种疾病模型的验证所得到的实验数据和临床应用存在一定的局限性。因此，通过生物信息学软件来综合分析新突变的致病性成为另一种简单可行的方法。在本研究中，我们报道了一新的ITGA2B基因突变，并采用生物信息学软件对该新突变的致病性进行分析，探讨新的基因型和临床表型之间的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

1个血小板无力症家族(1例患者及3个家庭成员)纳入了本次研究。患者女性，年龄28岁，主要因“自幼反复牙龈出血”多次住院，并有消化道大出血史。根据Solh等[8]对血小板无力症的诊断和分型标准，该患者属于1 型血小板无力症。根据改良的世界卫生组织的出血评估标准[9]，该患者出血风险等级为Ⅲ级。其他家庭成员无出血史，患者父母无近亲结婚史。本研究通过汕头大学医学院第一附属医院伦理委员会批准，伦理号为：汕大医附一院伦审-科研-第2020-082号。患者及家系成员均签署知情同意书。

1.2 方法

图1 外周血涂片

1.2.1 表型分析血小板计数采用LH780 全自动血细胞分析仪(美国贝克曼库尔特公司)进行检测；凝血功能采用CS5100全自动凝血分析仪(日本希森美康公司)进行检测；血管性血友病因子(vWF)送至广州金域医学检验中心利用免疫比浊法进行检测；外周血涂片行瑞氏-吉姆萨染色后显微镜下观察血小板形态；血栓弹力图采用CFMS LEPU-8800血栓弹力图仪(北京乐普医疗科技有限责任公司)进行检测。用EDTA 抗凝管采集患者及家庭成员全血后送至广州金域医学检验中心，采用FASCCantoⅡ流式细胞仪(美国BD 公司)分别检测血小板表面CD41(GPⅡb)、CD61(GPⅢa)、CD42b的表达。

1.2.2 DNA 测序分析EDTA 抗凝管采集患者全血，送至深圳荻硕贝肯精准医学有限公司进行全外显子测序， 采用Agilent Sureselect Target Enrichment 系统进行外显子捕获，然后用Hiseq X测序仪(美国Illumina 公司)进行双末端测序，最后采集家系其他成员全血进行一代测序以确定ITGA2B基因突变在家系中分布情况。

1.2.3 新突变位点空间结构模型分析根据已知的GPⅡb/GPⅢa 蛋白结构模型，构建突变位点的蛋白质空间模型，采用SWISS-MODEL 软件分析突变位点对蛋白质空间结构的影响。

2 结果

2.1 表型分析结果

患者及其母亲、哥哥的血小板计数、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(Fib)、血小板形态(图1)等均基本正常。患者血小板聚集功能明显下降，血小板CD41(GPⅡb)和CD61(GPⅢa)表达均明显下降、CD42b表达正常，其家庭成员CD41、CD61 及CD42b 表达均正常(表1)。患者血管性血友病因子抗原(vWF:Ag)：103.0%(正常参考范围50.0%～160.0%)。

2.2 全外显子测序结果

全外显子测序分析显示：ITGA2B、VWF等9个与出血性疾病相关基因的位点发生突变(表2)，而ACTN1、ITGB3、ITGA2、RASGRP2、MYH9等可能与血小板无力症致病相关的基因均未检测到突变。

表1 患者家系基本情况及表型结果

表2 全外显子测序部分结果

2.3 ITGA2B基因一代测序结果

图2 ITGA2B基因c.1096C>T杂合突变

一代测序结果显示，患者及患者姐姐检测到ITGA2B： c.1096C>T 杂合突 变 (图2)， 该突变 使ITGA2B基因12号外显子的第1096号核苷酸由C突变成T，形成一个终止密码子，为无义突变。该突变在PubMed数据库中未检索到，因此我们认为是一新的突变。另外，患者、患者哥哥及患者母亲检测ITGA2B：c.1063G>A 杂合突变(图3)，该突变使位于ITGA2B基因外显子12 的第1063 号核苷酸由G突变成A，导致编译的第355号谷氨酸变为赖氨酸。

图3 ITGA2B基因c.1063G>A杂合突变

2.4 家系分析

家系分析显示，ITGA2B：c.1096C>T 可能遗传自患者父亲(已故)，患者姐姐为该突变携带者；ITGA2B：c.1063 G>A 遗传自患者母亲，患者哥哥及母亲为该突变携带者，见图4。

2.5 新突变位点的蛋白空间结构模型分析

ITGA2B：c.1096C>T(p.R366X)发生无义突变后，导致GPⅡb中的第366个氨基酸由X取代R氨基酸。蛋白质空间结构模型分析显示，该无义突变形成一个约含335 个氨基酸残基的截短蛋白(1～31为信号肽)，导致GPⅡb不能与GPⅢa形成完整的复合物(图5)。

图4 家系图谱

图5 GPⅡb和GPⅡb/Ⅲa新突变位点空间结构模型

3 讨论

本研究发现ITGA2B基因发生了一个新的杂合突变：c.1096C>T，该无义突变使翻译的GPⅡb蛋白缩短，最终形成一个约335 个氨基酸残基的截短蛋白(1～31 为信号肽)。根据美国医学遗传学与基因组学学会指南[10]，该变异为致病性位点。O’Toole 等[11]的研究显示：一方面，无义突变后形成的截短的蛋白很不稳定，合成后马上在细胞内降解；另一方面，因为未复合亚基的快速翻转，截短的蛋白同时会导致GPⅢa 在血小板表面的明显缺乏。这也解释了本研究中尽管患者ITGB3基因未发生突变，但GPⅡb 和GPⅢa 的表达均明显缺乏。综上，突变后的GPⅡb明显缩短，导致GPⅡb不能与GPⅢa形成完整的复合物，因此该新突变可能导致了血小板无力症的发生。

本研究同时发现ITGA2B基因存在一个已知的错义突变：c.1063G>A。该突变可通过多种形式影响蛋白质的功能。一方面，该突变位于GPⅡb 的第二个和第三个钙离子结合结构域之间，由于突变前的谷氨酸带负电荷，突变后的赖氨酸带正电荷，故该突变影响了此区域的电荷性质[12]。另一方面，Basani等[13]的研究表明，该突变是通过影响不成熟GPⅡb/Ⅲa 复合物的构象，使其不能从内质网转运到高尔基体，致使前GPⅡb(Pro-GPⅡb)不能正常的剪切成重链和轻链，从而致病。本研究中，患者哥哥及母亲只是携带者，尚有一个正常的等位基因可以合成正常的GPⅡb，故患者哥哥和母亲的GPⅡb和GPⅢa表达正常，未发病。

综上所述，本研究发现了一个新的ITGA2B:c.1096C>T(p.R366X)突变，可能导致了血小板无力症，但该突变的致病性仍需体外实验验证，以获取直接的致病性证据，进一步阐明该突变导致血小板无力症的发病机制。