阮易柔,吴智华,吴士筠,钟祖昌,覃瑞,刘虹

(中南民族大学 生命科学学院, 武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室， 武汉 430074)

随着全球气候变暖与极端自然灾害的频繁发生，高山植物的生存受到了一定的威胁. 高山植物的自然更新关键取决于种子的成熟、萌发与生长等连续性过程. 种子萌发是一系列有序的生理变化和形态发生过程，需要适宜的环境条件，如水分、空气和温度等. 当植物种子从高山转移至平原地区后，各种环境条件发生改变，有可能制约种子的萌发.

金腰属植物富含黄酮和三萜类化合物，具有良好的抗肿瘤和抗病毒作用[1-3]. 中华金腰(Chrysospleniumsinicum)为多年生草本植物，生长在海拔800～3500 m且生态环境较为原始的林下沟边.中华金腰分布于我国大部分省区. 中华金腰作为一种民间中草药被记载，俗称华金腰子，全草入药，具有清热退黄的作用[4-9]. 因其种子细小、种皮坚硬、休眠性强，在自然条件下萌发率较低，因此多为无性繁殖. 同时中华金腰对生长环境要求较高，难以进行人工种植,局限了中华金腰的研究和应用.本研究拟通过光照、低温、赤霉素等因素对种子萌发的影响来探究中华金腰种子的萌发特性,同时为金腰属植物的种子萌发和快速繁殖提供科学参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料

中华金腰(Chrysospleniumsinicum)植株于2019年3月采集于湖南省八大公山国家级自然保护区，后移植于中南民族大学实验苗圃，定期浇水. 2019年4月待果实成熟后收获种子.

1.2 储存方式处理与形态观察

中华金腰种子在常温下用硅胶进行干燥. 扫描电镜(SU 8010型，日立)对干燥后的种子进行形态观察并拍照. 种子采用常温避光储存与4 ℃低温种子柜储存两种存储处理方式，并分别进行萌发实验.

1.3 光处理

设置2个光处理水平，分别为光照环境与黑暗环境. 光照处理环境温度为22 ℃，光照强度为3000 lx，光照时间16 h/d. 黑暗环境温度为22 ℃.

1.4 低温处理

设置5 ℃的低温处理水平，低温分别处理2周、3周和4周，然后再进行自然萌发. 萌发温度22 ℃，光照强度3000 lx，光照时间为16 h/d.

1.5 赤霉素浸种处理

对于赤霉素处理设计梯度实验，浸种时间设3个水平分别为12、24、36 h，赤霉素浓度设6个水平分别为0、50、100、150、200、250 mg/L，进行种子浸泡处理，然后自然萌发，环境温度为22 ℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/d.

1.6 数据统计与处理

根据每天记录的发芽情况，进行发芽各项指数的计算及分析. 体式显微镜(Stemi 305,德国蔡司)下观察种子形态，以胚根露出2 mm记为萌芽. 从处理当天开始，每24 h记录一次发芽状态. 连续3 d萌发数不变则视为萌发进程结束. 统计发芽率、发芽势、萌发时滞、发芽持续时间、发芽指数. 实验所得数据用Excel 2016与SPSS 19.0进行作图与数据分析.

(1)发芽率=(种子发芽总数/供试种子总数)×100%

(2)发芽势=(发芽达到最高峰时的种子数/供试种子总数)×100%

(3)萌发时滞：从发芽试验开始那天到第一个种子萌发的所需的时间.

(4)发芽持续时间：从种子开始萌发至最后一粒种子萌发的天数.

(5)发芽指数=∑(Gt/Dt)，Gt表示在试验期内种子发芽数，Dt表示试验期天数[10-12].

2 实验结果

2.1 种子形态特征

中华金腰种子形态特征如图1所示. 种子长度约0.6 ～ 0.9 mm，直径约0.45 mm，黑褐色，呈卵球形至椭球形，两端顿尖，具一条纵肋，表面密被乳头突起. 种皮坚韧，对其萌发有一定的限制作用. 表面的突起可能对于其通过水流进行飘流传播有一定的作用. 百粒法测定千粒重为(0.0503 ± 0.0007)g.

图1 中华金腰种子扫描电镜图Fig.1 Seed image of Chrysosplenium sinicum

2.2 储存方式对中华金腰种子萌发的影响

通过对两种不同储存方式的种子进行萌发实验，发现萌发率具有显著的差异. 对室内干燥避光条件下储存的种子进行萌发实验，中华金腰种子在室内自然条件与赤霉素处理后均不能萌发. 储存于4 ℃低温种子柜内一个月后再进行萌发实验，自然条件下萌发率为6.67%，经过100 mg/L GA3浸种处理24 h后最大萌发率为31.67 %. 储存于低温种子柜内2个月后进行萌发实验，发现室内条件下自然萌发率提高到86.67 %，差异极显著(P< 0.01)(图2). 而对植株上新鲜收取的种子进行萌发实验，发现不能自然萌发.因此推断中华金腰种子具有后熟休眠特性，且低温春化作用对其萌发有益.

(o)未经任何处理的对照组；(a)4 ℃低温储存一个月后自然萌发；(b)4 ℃低温储存一个月后经过100 mg/L GA3 浸种处理24 h后萌发；(c)低温储存2个月后进行自然萌发图2 储存方式对发芽率的影响Fig.2 Effect of storage methods on germination rate

2.3 光照对中华金腰种子萌发的影响

对比光照与黑暗处理后萌发各项指数，光照处理的种子发芽率为86.67 %、发芽势为54.44 %与发芽指数为9.84,显著(P< 0.05)高于黑暗处理的发芽率68.89 %、发芽势30.00 %与发芽指数6.69，且光照条件下萌发时滞与发芽持续时间较黑暗处理更具优势(图3). 因此光照较之黑暗更有利于中华金腰种子的萌发.

图3 光照与黑暗对萌发的影响Fig.3 Effects of light and darkness on germination

2.4 低温处理对中华金腰种子萌发的影响

低温处理对中华金腰种子的萌发具有显著影响(表1)，随低温处理时间的增加，发芽率和发芽势呈现先减后增的趋势，萌发指数呈现显著上升趋势，萌发时滞与发芽持续时间显著减少. 将无低温处理(即低温处理时间为0)作为对照组. 在处理2周后，发芽率显著降低到74.44 %，在处理3周、4周后，发芽率相对于处理2周组显著增加到86.67 %. 发芽势在处理2周时为36.67 %，处理4周后显著增加到 70.00 %. 处理4周后，萌发时滞和发芽持续时间从对照组的10.33 d与12.33 d显著降低到 2.33 d与 7.00 d；发芽指数从对照组的9.84 显著增加到19.72 (P< 0.05).

表1 低温处理对中华金腰种子萌发的影响Tab.1 Effect of low temperatureon on the seed germination of Chrysosplenium sinicum

2.5 赤霉素浸种处理对中华金腰种子萌发的影响

赤霉素浸种处理对中华金腰萌发各项指数的影响见表2，在赤霉素浓度与浸种时间的交互作用下，中华金腰种子的各项萌发指数呈现出不同的变化(P<0.05). 以赤霉素浓度为0作为对照，可知种子发芽率最高的处理条件为150 mg/L GA3浸种12 h，发芽率最高为 97.78 %，在200 mg/L GA3浸种24 h时，发芽率最低为 83.33 %，且低于对照组. 发芽率随赤霉素浓度增加呈现先升高再减小的变化趋势，在赤霉素浓度为150 mg/L时达到最大. 赤霉素浓度的变化对发芽势影响显著，处理条件为250 mg/L GA3浸种36 h时，发芽势达到最大80.00 %，在0 mg/L GA3浸种24 h时，发芽势最低为36.67 %，浸种时间在0 mg/L GA3与200 mg/L GA3时影响显著，呈现先减后增的趋势. 赤霉素浓度的变化对萌发时滞影响显著，总体随着赤霉素浓度增加而减小，处理条件在50 mg/L GA3浸种24 h时萌发时滞最小为3.33 d，组内萌发时滞随浸种时间增加而增加. 赤霉素浓度的变化对发芽持续时间影响显著，处理条件在250 mg/L GA3浸种36 h时萌发时滞最小为 5.00 d. 在赤霉素浓度相同的组内，浸种时间对于发芽持续时间影响显著，随着浸种时间增长而减少. 赤霉素浓度变化对于发芽指数影响不显著，浸种时间对于发芽指数影响显著，且随浸种时间增加而减小，处理条件在0 mg/L GA3浸种12 h时发芽指数最大为14.79.

表2 赤霉素浓度与浸种时间对中华金腰种子萌发的影响Tab.2 Effect of GA3 concentration and soaking time on the seed germination of Chrysosplenium sinicum

3 讨论

种子自身特性与环境因子是影响种子萌发的主要因素. 对于高山植物来说，种子休眠是影响其萌发的重要生理特征，通过种子休眠可以帮助高山植物度过恶劣的环境. 本研究结果表明中华金腰种子在植株上成熟后不能立即萌发，需要经过一段时间低温储藏后才具有较高的发芽率，表明其具有后熟休眠特性. 此外，本研究结果表明光照有利于中华金腰种子的萌发.

有研究表明[17, 18]，高山植物种子萌发前需经过冷层积的过程，且萌发率显著高于未经过冷层积的种子. 本研究表明低温处理可以缩短中华金腰种子的萌发时滞，且呈明显负相关；发芽率、发芽势与发芽指数随低温处理时间增多而增加，呈正相关关系，验证了高山植物需经冷层积过程这一观点.

赤霉素是一种广谱植物生长促进激素，参与植物生活史的多个过程. 在农业生产中常用来促进种子的萌发. 本研究结果表明适宜浓度的赤霉素能促进中华金腰种子的萌发. 赤霉素浓度在150 mg/L浸种12 h时，中华金腰种子发芽率达到最高97.78 %. 设置赤霉素浓度梯度可以探究适合于中华金腰种子萌发的结果与种子喜好的赤霉素浓度的关系. 本研究中设置的赤霉素浓度范围还不够广，部分发芽指标差异不够明显，后续将进一步拓展加深.

高山植物由于其特殊的生境而对环境和人为条件非常敏感. 适宜的环境条件可以促进种子的萌发，当超过一定的范围后反而会抑制萌发. 除了非生物因素，生物因素也是影响高山植物在低海拔地区萌发的重要条件. 综合多种因素的探究能更加全面且客观地给中华金腰这种高山植物在低海拔地区的生长繁殖及进一步的种质资源研究提供有价值的依据. 本研究也为同属其他物种的种质资源保护与扩繁提供了科学依据.