摘 要：为了建立准确、简便、灵敏、重现性好的莓茶代用茶中总黄酮（以二氢杨梅素计，下同）的检测方法，特对检测试剂、检测波长、显色反应条件等进行优化。结果表明：用70%乙醇50℃超声提取4次（提取率达99.814%），以三氯化铝和醋酸钾进行显色反应，在294 nm波长处检测吸光度值，获得标准曲线方程Abs =0.043 74 C×0.012 36，相关系数为0.999 94，线性范围2.48～19.84 μg/mL。经验证，该检测方法重现性良好，相对标准偏差RSD（n=5）为0.980 7%;精密度良好，相对标准偏差RSD（n=5）为0.092 9%～0.415 5%;显色反应1 h内稳定性良好，吸光度值及检测浓度值相对标准偏差RSD（n=5）为0.565%～1.178%。该方法最低检测浓度为0.35 μg/mL。

关键词：莓茶代用茶;总黄酮;二氢杨梅素;检测方法;优化

中图分类号：S567; O652 文献标识码：A文章编号：1006-060X（2020）10-0098-05

Abstract： To develop an accurate， simple， sensitive and repeatable method for the detection of total flavones （calculated in dihydromyricetin） in Ampelopsis grossedentata tea-like drink （one of tea substitutes）， the optimization for test reagents， detection wavelength selection and color reaction was made. Ultrasonic extraction was conducted with 70% ethanol at 50 °C for 4 times （the extraction rate was 99.814%）， color reaction was performed with aluminum trichloride and potassium acetate， the absorbance value was measured at 294 nm， then a standard curve equation Abs =0.043 74×C-0.012 36 was constructed where the correlation coefficient was 0.999 94， and the linear range was 2.48～19.84 μg/mL. The results have proved that the method is of a good repeatability with the relative standard deviation RSD （n=5） of 0.980 7% ， and high accuracy with the RSD （n=5） of 0.092 9%～0.415 5%. The color reaction is stable within 1h， and the RSD （n=5） is 0.565%～1.178% for the absorbance value and the detected concentration value. The minimum detection concentration of this method is 0.35 μg/mL.

Key words： Ampelopsis grossedentata tea-like drink; total flavones; dihydromyricetin; detection method; condition optimization

葡萄科蛇葡萄属显齿蛇葡萄（Ampelopsis grossed-entata），俗名莓茶，又称为藤茶、茅岩莓等。莓茶是一种野生藤本植物，广泛分布于我国湖南、湖北、贵州、江西等省份，其鲜叶可加工成莓茶代用茶，故被广泛人工种植。湖南省湘西州种植莓茶历史悠久，有“溪洲莓茶”、“永顺莓茶”（国家农产品地理标志登记，己通过评审）等标志或品牌[1]。2013年12月24日原国家卫生和计划生育委员会，将莓茶叶纳入可用于食品生产加工的新食品原料管理[2]，从此，莓茶代用茶纳入我国食品生产许可发证范围。2019年国家卫健委将莓茶叶列入最新版食药同源目录[3]，由此开启莓茶叶食药两用新用途的广阔发展空间。近年来莓茶代用茶产业己成为湘西自治州永顺县和凤凰县脱贫攻坚及乡村振兴的政府扶持项目。同时莓茶食用药用价值研究成为广大科研工作者的研究方向，张红忠等[4]综述了藤茶的植物学研究与加工、化学成分和药理作用;刘慧颖等[5]总结了莓茶的化学成分及药理作用的研究进展;冯涵林等[6]对藤茶中黄酮类成分的功效进行了综述。

食品中总黄酮的测定方法主要有直接测定法、薄层色谱法、分光光度计比色法等，食品中黄酮单体成分测定方法主要是高效液相色谱法。比色法具有快速、简单、准确的特点，测定食品中总黄酮时常用比色法有直接比色法（如保健食品中总黄酮的测定[7]）、显色剂比色法（如三氯化铝416 nm比色法[8]、三氯化铝-醋酸钾415 nm比色法[9]、硝酸铝-醋酸钾415 nm比色法[10]、亚硝酸钠-氯化铝-氢氧化钠510 nm比色法[11]）等，通常，會根据产品的特性选择不同的检验方法。经查文献资料，莓茶或藤茶中总黄酮检测研究有秦亚茹等[12]藤茶总黄酮检测方法的对比研究，李宇等[13]利川市藤茶黄酮成分研究，其中藤茶中总黄酮的代表成分主要为二氢杨梅素和杨梅素等。

为了建立一套准确、简便、灵敏、重现性好的莓茶代用茶中总黄酮（以二氢杨梅素计，下同）的检测方法，为莓茶代用茶及其总黄酮的开发应用提供检测方法、应用基础和质控标准，笔者拟用三氯化铝醋酸钾为显色剂，对检测试剂、检测波长及显色反应条件等进行优化。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪 器 UV-2550紫外可见分光光度计（日本岛津）、BSA-224S分析天平（赛多利斯）、JY502天平（上海浦春计量）、KQ5200V型超声波清洗器、DZKW电热恒温水浴锅、ZWT-H1-20超纯水机（中沃水务）、常用玻璃器皿等。

1.1.2 试 剂 无水乙醇（UV-HPLC，含量≥99.9%;AR，含量≥99.7%）;95%乙醇（AR）;90%、70%、30%乙醇水溶液（自配）;三氯化铝（AR，含量≥99.0%）;25 g/L三氯化铝;醋酸钾（AR，含量≥92.0%）;冰醋酸（AR，含量≥99.5%）;98.2 g/L醋酸钾（100 mL中含4 mL冰醋酸）。

1.1.3 标准品 以中药对照品二氢杨梅素（A0049 20 mg，含量99.57%）为试验标准品;称取0.012 4 g二氢杨梅素用95%乙醇溶解定溶至25 mL容量瓶中，配成496 μg/mL标准贮备液Ⅰ;标准贮备液Ⅰ用95%乙醇稀释10倍，配成49.6 μg/mL标准使用液Ⅱ;标准使用液Ⅱ用95%乙醇稀释10倍，配成4.96 μg/mL标准使用液Ⅲ。

1.1.4 试验样品 检测样品为湖南省永顺县毛坝乡、砂坝乡、润雅乡、石堤镇、万民乡及万坪镇等乡镇莓茶生产企业的成品，试验样品为湖南省市场监督管理局科技项目（2020KJJH72）的研究样品。样品在实验室进行简单复干（70℃恒温复干0.5 h）→粉碎→备用。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理 精确称取约0.5 g干燥的莓茶粉末置于100 mL比色管中，加入70%乙醇溶液25 mL浸润混匀，在50℃水浴超声提取0.5 h，趁热过滤至100 mL容量瓶中，如此重复提取4次，合并提取液并用70%乙醇清洗残渣和滤纸，用70%乙醇定容至100 mL，摇匀静置（必要时进行4 000 r/min离心8 min处理），此提取液必要时可用70%乙醇进行稀释，备用或4℃保存备用。

1.2.2 标准品配制及样品检测 精确吸取标准使用液Ⅱ（49.6 μg/mL二氢杨梅素标液）0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 于 10 mL 比色管中，二氢杨梅素标准系列浓度为0、2.48、4.96、9.92、14.88、19.84 μg/mL;精确吸取样品处理液1.5～2.0 mL于10 mL 比色管中;在标准系列和样品比色管中先加入一定量70%乙醇液，再加入25 g/L三氯化铝2 mL摇匀放置5 min后，再加入98.2 g/L醋酸钾2 mL，用70%乙醇定容摇匀，显色反应15 min后于294 nm波长处测定吸光度值。

1.2.3 结果计算 以标准品浓度值为横坐标、吸光度值为纵坐标得标准曲线方程，按下列公式计算出所测样品中总黄酮含量。

式中C为总黄酮含量（g/kg），ρ为样品处理液检测浓度（μg/mL），由样品吸光度值代入线性方程而得出，10为比色管定容体积（mL），m为莓茶的质量数（g），V1为比色用处理液体积（mL），V2：处理液定容体积（mL），F为处理液稀释倍数，1 000为单位换算系数。

2 结果与分析

2.1 试验条件验证

2.1.1 试验用水验证 用UV-2550仪对试验用纯净水和超纯水（实验室自制）在200～900 nm波长进行光谱扫描，扫描结果显示，2种试验用水在200～900 nm波长范围内均无吸收峰，且2种试验用水在250～900 nm光谱图平直一致，说明2种试验用水无吸收峰均不影响试验结果，故该试验用纯净水即可。

2.1.2 试验用有机溶剂验证 试验各种乙醇溶液（液相色谱纯无水乙醇、AR市售无水乙醇、95%市售乙醇、90%自配乙醇液、70%自配乙醇液、30%自配乙醇液）在200～700 nm波长范围进行光谱扫描，扫描结果显示，6种乙醇溶液在200～700 nm波长范围内均无吸收峰，且在250～700 nm光谱图平直一致，说明6种乙醇溶液均能满足试验要求。综合考虑，试验用有机溶剂选择AR无水乙醇、95%AR乙醇及70%乙醇即可。

2.1.3 单一显色试剂验证 分别吸取25 g/L三氯化铝和98.2 g/L醋酸钾各2 mL到2支10 mL比色管中，并用70%乙醇定容混匀，在200～900 nm波长范围进行光谱扫描，扫描结果显示，2种单一显色反应试剂在200～900 nm波长范围内均无吸收峰，且在约250～900 nm光谱图平直一致，表明2种单一显色剂能满足试验要求。

2.1.4 混合显色试剂验证 取少量70%乙醇于10 mL比色管中，加入25 g/L三氯化铝2 mL摇匀，放置5 min后加入98.2 g/L醋酸钾2 mL，用70%乙醇定容摇匀，放置15 min后在200～900 nm波长范围进行光谱扫描，扫描结果显示，2种显色反应试剂混合后在200～900 nm波长范围内均无吸收峰，且在约250～900 nm光谱图平直，表明2种显色试剂混合后能满足试验要求。

2.1.5 同浓度二氢杨梅素标准溶液加与不加显色剂光谱扫描（即检测波长选择） 配制二氢杨梅素标准溶液430 μg/mL（称取二氢杨梅素0.004 3 g，用95%乙醇溶解定容于10 mL容量瓶中），准确吸取此标准溶液0.2 mL分别置于2支10 mL比色管中（即浓度为8.6 μg/mL），其中1支比色管按1.2.2标准系列显色方法进行显色反应，放置15 min后进行光谱扫描;另1支比色管用70%乙醇定容摇匀，放置15 min后扫描，扫描结果显示，未加显色剂的二氢杨梅素标准溶液其在294.5 nm和328.5 nm波长处有不明显吸收峰，且两峰间峰形相连，此光谱图与二氢杨梅素标準溶液液相光谱图（290 nm有吸收峰，约330 nm吸收峰不明显）相似;加入显色剂的二氢杨梅素标准溶液在294 nm波长有唯一明显最大吸收峰，Abs值为0.536。由此即验证二氢杨梅素标准溶液与显色剂反应后在294 nm波长处有唯一明显最大吸收峰。

2.1.6 不同浓度二氢杨梅素标准溶液加显色剂光谱扫描（即检测波长选择） 配制不同浓度二氢杨梅素标准系列（浓度为2.397 5、4.795、9.590、14.385、19.180、23.975 μg/mL），按1.2.2标准系列显色方法进行显色反应，放置15 min后扫描，扫描结果显示，二氢杨梅素标准系列浓度与其吸收峰Abs值大小成一定正比例关系。综合分析1.3.5和1.3.6，二氢杨梅素标准溶液加入显色剂扫描，在294 nm波长处有唯一明显最大吸收峰，且浓度与吸光度值成正比例关系。故此法选择检测波长为294 nm。

2.1.7 样品溶液及二氢杨梅素标准溶液加与不加显色剂光谱扫描（即检测波长选择及总黄酮以二氢杨梅素计的验证） 称取样品0.515 7 g按1.2.1方法进行提取，提取液再按1∶25进行稀释，吸取稀释液1.5 mL分别置于2支10 mL比色管中，其中1支比色管按1.2.2样品显色方法进行显色反应，放置15 min后扫描;另1支比色管用70%乙醇定容摇匀，放置15 min后扫描，扫描结果显示，未加显色剂的样品溶液其在294 nm波长处有不明显吸收峰，在约330 nm波长处有不明显吸收峰，且2个不明显吸收峰之间峰形相连，此峰形与二氢杨梅素标准溶液未加显色剂光谱扫描图一致;加入显色剂的样品溶液在294 nm波长有唯一明显最大吸收峰，Abs值为0.681。

再比较二氢杨梅素标准溶液和样品加入显色剂光谱扫描结果显示，二氢杨梅素标准溶液和样品加显色剂光谱扫描图一致，在294 nm波长有唯一明显最大吸收峰，且标准溶液浓度与吸光度值成正比例关系。

综合分析1.3.5～1.3.7，科学验证莓茶中总黄酮检测，用三氯化铝醋酸钾为显色试剂，在294 nm波长处测其吸光度值。

2.1.8 同浓度芦丁标准溶液加与不加显色剂光谱扫描（即验证莓茶总黄酮不以芦丁计） 以中药对照品芦丁为标准品（CAS号153-18-4，含量98.41%），配制芦丁标准溶液128 μg/mL（称取芦丁0.012 8 g，用95%乙醇溶解定容100 mL容量瓶），准确吸取芦丁标准溶液1.5 mL分别置于2支10 mL比色管中（即浓度为19.2 μg/mL），其中1支比色管按1.2.2显色方法进行显色反应，放置15 min后光谱扫描;另1支比色管用70%乙醇定容摇匀，放置15 min后光谱扫描，扫描结果显示，未加显色剂的芦丁标准溶液其在258 nm和363.5 nm波长处有吸收峰，此光谱图与芦丁标准溶液相光谱图一致（在256 nm和354 nm波长处有吸收峰），且两峰间峰形相连;加入显色剂的芦丁标准溶液在269.5 nm和409.5 nm有吸收峰，且两峰间峰形相连。同浓度芦丁标准溶液加与不加显色剂光谱图峰形一致，芦丁标准溶液加入显色剂后吸收峰延后。

再比较分析二氢杨梅素标准溶液（8.6 μg/mL）、芦丁标准溶液（19.2 μg/mL）和样品加入显色剂光谱扫描结果显示，莓茶总黄酮检测以二氢杨梅素计而不宜以芦丁计，检测波长为294 nm。

通过以上试验及综合分析1.3.1～1.3.8，充分验证莓茶总黄酮的检测，采用三氯化铝醋酸钾显色反应，在294 nm波长处有唯一明显最大吸收峰，且标准溶液浓度值与其吸光度值成正比例关系。

2.2 标曲线性绘制

根据不同浓度范围的二氢杨梅素标准溶液，获得标准曲线①、②、③、④，其线性方程分别为Abs1=0.043 74×C1-0.012 36、Abs2=0.044 04×C2-0.062 01、Abs3=0.043 73×C3+0.033 07、Abs4=0.042 02×C4 +0.001 50，如表1所示，标准曲线①二氢杨梅素浓度范围为0～19.84 μg/mL，吸光度值0～0.869，经分析，其估计的标准误差为0.067 74 μg/mL，残余标准偏差为0.060 59 μg/mL，相关系数为0.999 94;标准曲线②二氢杨梅素浓度范围为0～29.76 μg/mL，吸光度值0～1.317，其估计的标准误差为0.123 91 μg/mL，残余标准偏差为0.114 72 μg/mL，相关系数为0.999 89;标准曲线③二氢杨梅素浓度范围与标准曲线①相同，吸光度值为0～0.870，其估计的标准误差为0.045 02 μg/mL，残余标准偏差为0.040 26 μg/mL，相关系数为0.999 97;标准曲线④二氢杨梅素浓度范围为0～4.96 μg/mL，其吸光值0～0.208，估计的标准误差为0.002 23 μg/mL，残余标准偏差为0.002 00 μg/mL，关系数为0.999 38。分析显示，4个系列标准曲线均在预测标准误差线和95%置信水平线线内（电脑系统查得），相关系数均≥0.999 38，远大于标准要求（0.99）[14]，表明这些标准曲线符合朗伯比耳定律，偏离度较小或影响较小，稳定性良好，同時考虑吸光度值（Abs值）不宜过大，试验以2.48～19.84 μg/mL范围作为检测分析依据。

2.3 最佳提取次数

称取莓茶样品0.554 2 g按1.2.1进行分次提取试验，第一次提取液用70%乙醇定容至50 mL，再以体积比1∶50稀释;第二次提取液用70%乙醇定容至50 mL，再以体积比1∶10稀释;第三、四次提取液用70%乙醇定容至50 mL;第五、六次提取液用70%乙醇定容至25 mL;检测每次提取液样品浓度，提取次数试验结果及数据分析见表2。由表2分析可见，总黄酮第一次提取率93.464%，前两次提取率达99.160%，前三次提取率达99.673%，前四次提取率达99.814%。综合分析得出莓茶总黄酮检测70%乙醇提取四次合并定容为佳，提取率达99.814%。

2.4 重现性试验结果

准确称取5份样品各约0.5 g按1.2进行检测。重现性试验结果及数据分析见表3。由表3分析可见，标准偏差S为0.404 8，相对标准偏差RSD（n=5）为0.980 7%，RSD值远小于 5.0 %;同时再分析比较标曲①和标曲③检测数据，可见5个同浓度标曲点对应的Abs值也非常接近，说明该试验方法平行样检测及标曲系列测定重现性较好。

2.5 精密度试验结果

配制二氢杨梅素标准浓度点4.960、9.920和14.880 μg/mL，精确吸取样品1稀释液1.0、1.5 mL，标准点和样品按1.2.2进行显色反应，在294 nm波长处连续测定检测浓度值5次，精密度试验结果及数据分析见表4。由表4分析可见，5组精密度试验其检测浓度RSD（n=5）值0.092 9%～0.415 5%，均远小于5%，其中3组标准浓度点其标准值与检测平均值比值在95.320 5%～99.542 4%，均大于95%，表明显色反应吸光度值稳定、仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验结果

分别吸取二氢杨梅素标准使用液Ⅱ2 mL和5 mL到2支25 mL比色管中，配制成二氢杨梅素标准点3.968和9.92 μg/mL;精确吸取样品1稀释液3.75 mL到2支25 mL比色管中，配制成同浓度的样品检测液1-1和1-2。标准点和樣品按1.2.2加入显色剂，用70%乙醇定容至25 mL，测定标准点和样品不同显色反应时间吸光度值及检测浓度值，试验结果及数据分析见表5。从表5分析可见，吸光度值及检测浓度值在2 h内稳定性良好，相对标准偏差RSD（n=5）在0.565%～1.178%，均小于5%;且2组标准点的标准值与检测平均值比值为96.993%和99.729 %。证明该方法显色反应2 h内稳定性良好，综合分析此显色反应在1 h内完成比色工作最佳。

2.7 最低检测浓度

将低浓度标准溶液（标曲④）进行再稀释检测其浓度，以了解此法对标准溶液低浓度的检出情况。通过多次试验，得知该方法最低检测浓度为0.35 μg/mL，吸光度值0.015，如浓度更低则其吸光度值将不稳定。

3 结 论

试验通过光谱扫描验证试验用水、试验用有机溶剂、单一显色试剂和混合显色试剂，证明试验用材料对该试验无影响;通过比较分析二氢杨梅素标准溶液加与不加显色剂光谱扫描、不同浓度二氢杨梅素标准溶液加显色剂光谱扫描、样品溶液加与不加显色剂光谱扫描以及二氢杨梅素液相色谱光谱比较，确定检测波长为294 nm;通过比较分析芦丁标准溶液加与不加显色剂光谱扫描、样品、二氢杨梅素及芦丁加与不加显色剂光谱扫描，得出莓茶中总黄酮检测以二氢杨梅素计较适宜。

莓茶中总黄酮（以二氢杨梅素计），用70%乙醇50℃超声提取4次（提取率达99.814%），用三氯化铝和醋酸钾显色反应，在294 nm波长处检测吸光度值，该方法标准曲线线性范围2.48～19.84 μg/mL，吸光度值0.112～0.869，标准曲线方程Abs =0.043 74×C-0.012 36，相关系数0.999 94。该方法重现性良好，相对标准偏差RSD（n=5）为0.980 7%;该方法及仪器精密度良好稳定，相对标准偏差RSD（n=5）为0.092 9%～0.415 5%，标准浓度值与检测平均值比值95.320 5%～99.542 4%;该方法显色反应1 h内稳定性良好，吸光度值及检测浓度值相对标准偏差RSD（n=5）为0.565%～1.178%，标准浓度值与检测平均值比值96.993%～99.729%;该方法最低检测浓度0.35 μg/mL，吸光度值0.015。通过检测试剂验证、检测波长选择、显色反应验证和方法验证对该方法进行全面试验和验证，形成完整全面科学的莓茶总黄酮（以二氢杨梅素计）的检测方法，此检测方法具有准确、简便、灵敏、重现性好等特点，可为莓茶代用茶及其总黄酮的开发应用提供检测方法、应用基础和质控标准。

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（责任编辑：张焕裕）