余永昊，谢定源，方妍，范刚，丁璐

(华中农业大学 食品科学技术学院，环境食品学教育部重点实验室，武汉 430070)

辣椒(CapsicumannuumL.)，为木兰纲、茄科、辣椒属一年或有限多年生草本植物。适应性强，在世界各地普遍栽培，具有悠久的调味、着色、保存食物和作为药物的历史[1]。辣椒果实是一种药食同源的蔬菜，含有生物碱、色素、维生素、有机酸、矿物质等成分[2]。其中辣椒素是辣椒果实中的一类结构为N-香草基酰胺类生物碱的物质[3]，有辣味[4]，具有镇痛、抗炎、促进食欲、改善消化、减肥等药理作用[5-8]。近年的研究还表明辣椒素具有抗氧化作用[9]。

辣椒中辣椒素的含量主要与辣椒品种、栽培条件和提取方法有关[10-11]。目前常用的从辣椒中提取辣椒素的方法主要有溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法和超临界CO2萃取法[12]。溶剂提取法条件温和，可最大程度保留辣椒中的活性成分，节约能源，但存在溶剂污染和辣椒素得率低的问题[13]；超声波辅助提取法方法简单，所用时间短，提取条件温和，且具有较高的辣椒素得率[14-16]；微波辅助提取法劳动强度低，可以大大减少溶剂消耗，且辣椒素提取率相对较高[17-19]；超临界CO2萃取法不适用于实验室提取辣椒素，更适合商业化生产[20-21]。

以上提取方法适用于从辣椒原料中提取辣椒素，但无法用于从富含油脂的样品中提取辣椒素。若不对富含油脂的样品进行前处理，把中性油脂和辣椒素分离，那么后续用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)和液质联用(high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS)法对辣椒素进行检测时，色谱柱极易被污染、堵塞，导致色谱柱的使用寿命大大减少[22-23]。目前国内外从辣椒油中提取分离辣椒素的研究较少，若直接以70%乙醇在50 ℃水浴提取样品2 h，研究发现，在醇水体系和油脂两相共存时, 辣椒素几乎全部分配于醇水体系[24]；以Benzo I吸附剂为萃取填料，医用3 mL聚丙烯注射器为容器制作萃取小柱，该法样品前处理简单快捷，省时省力且有机溶剂消耗量低[25]；用氨基固相萃取小柱对样品进行前处理，辣椒素的平均回收率在70.6%～90.5%之间，且可有效去除油脂类物质及其他杂质[26]。

本研究旨在利用固相萃取(solid-phase extraction，SPE)能较好且省时省力地将辣椒素从辣椒油中提取分离出来的优点，对固相萃取过程中的相关条件进行进一步的优化，从而最终确定一种最佳的提取分离辣椒油中辣椒素的固相萃取工艺条件；采用HPLC对辣椒素进行定性与定量[27-28]，并通过加标回收率实验与日内精密度和日间精密度实验来检验固相萃取最佳工艺条件的可行性，旨在用一种较优的样品前处理方式处理辣椒油，为后续辣椒素的检测及其在油中的降解机理研究提供一个技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

“不怕辣”印度辣椒：山东乐畅调味品有限公司；金龙鱼精炼一级大豆油：益海嘉里(武汉)粮油工业有限公司。

1.2 主要试剂

辣椒碱(合成)标品、二氢辣椒碱标品：上海源叶生物科技有限公司；甲醇、异丙醇、乙腈(均为色谱纯)：国药集团化学试剂有限公司；丙酮(色谱纯)：天津市风船化学试剂科技有限公司；正己烷(色谱纯)：天津市科密欧化学试剂有限公司；乙酸乙酯(色谱纯)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 仪器与设备

LC-20型高效液相色谱仪 日本岛津公司；Platisil ODS液相色谱柱(250 mm，5 μm) 中国Dikma公司；LC-CQ-12F方形固相萃取仪 上海邦西仪器科技公司；HiCapt NH2固相萃取柱 武汉维泰克科技有限公司；Allegra X-30R台式高速冷冻离心机 美国Beckman Coulter 公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州恒岩仪器有限公司；YZ-1531-T多功能油炸锅 广东容声电器股份有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 辣椒前处理与辣椒油的制备

1.4.1.1 辣椒前处理

取适量辣椒样品于粉碎机中，粉碎1 min，粉碎后样品过40目筛，取筛下物辣椒粉，将辣椒粉置于4 ℃冰箱待用。

1.4.1.2 辣椒油的制备

将大豆油加热至170 ℃后，按辣椒粉∶大豆油为1∶4的比例，将大豆油浇于辣椒粉上，充分混匀，静置于室温后，用保鲜膜覆盖，放于4 ℃冰箱待用。

1.4.2 NH2萃取柱的活化

将NH2萃取柱与萃取仪连接后，依次用5 mL甲醇、3 mL丙酮和3 mL正己烷活化柱。

1.4.3 辣椒油前处理

取适量辣椒油于离心管中，10000 r/min，4 ℃离心15 min。取2 g上清液，用2 mL正己烷稀释待用。

将已经稀释的样液加入已活化的柱中，控制流速≤1 mL/min，待稀释液全部过柱后，加入5 mL正己烷淋洗，待正己烷过柱后，用真空泵把柱中的正己烷抽干净，再用4 mL 90%甲醇-乙腈溶液进行洗脱，待90%甲醇-乙腈溶液过柱后，用真空泵把柱中的90%甲醇-乙腈溶液抽干，收集洗脱液待用。

取全部洗脱液，用色谱级甲醇定容于10 mL容量瓶中，置于4 ℃冰箱中待用。

1.4.4 液相条件

色谱柱：Platisil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：V(甲醇)∶V(水)为70∶30，流速：1 mL/min，柱温箱温度：30 ℃，紫外检测波长：280 nm，进样量：10 μL[29]。

1.5 相关公式计算

1.5.1 辣椒碱含量计算

式中：w1为样品中辣椒碱含量，g/kg；c1为由标曲所计算的辣椒素含量，μg/mL；V为样品定容体积，mL；m为样品质量，g。计算结果保留到小数点后三位。

1.5.2 二氢辣椒碱含量计算

式中：w2为样品中二氢辣椒碱含量，g/kg；c2为由标曲所计算的辣椒素含量，μg/mL；V为样品定容体积，mL；m为样品质量，g。计算结果保留到小数点后三位。

1.5.3 辣椒素类物质总量计算

式中：w为样品中辣椒素含量，g/kg；0.9为辣椒素与二氢辣椒素折算为辣椒素类物质总量的系数。计算结果保留到小数点后三位[30]。

1.6 工艺优化实验说明

1.6.1 固相萃取条件的单因素实验

在前期实验的基础上，称取2 g离心后的辣椒油，用稀释剂正己烷用量分别为2，3，4，5，6，7，8 mL稀释后，5 mL正己烷淋洗，5 mL甲醇洗脱；用5 mL正己烷稀释，5 mL正己烷淋洗后，用洗脱剂种类分别为甲醇、异丙醇、乙腈、乙酸乙酯和10%、30%、50%、70%、90%的甲醇-乙腈溶液2 mL洗脱；用5 mL正己烷稀释，5 mL正己烷淋洗后，分别用体积为0.5，1，1.5，2，3，4，5 mL的甲醇溶液洗脱，研究这3个因素对辣椒油中辣椒素类物质提取的影响，均设置3次重复。

1.6.2 辣椒素提取的正交实验

表1 正交实验因素与水平Table 1 The factors and levels of orthogonal array design

由表1可知，以单因素实验为结果，选取稀释剂用量、洗脱剂种类和洗脱剂体积3个因素设计正交实验，每个因素设置4个水平，研究其对辣椒油中辣椒素类物质提取的影响，重复2次。

2 结果与分析

2.1 标准曲线和线性回归方程

标准溶液的配制参照厉志伟[31]，以液相峰面积Y(mAU·s)为纵坐标，物质质量浓度X(μg/mL)为横坐标，绘制得出的辣椒碱线性回归方程为Y=5027.8X+5725.6，R2=0.999;二氢辣椒碱线性回归方程为Y=4768.2X+1994.5，R2=0.9999。在样品中辣椒碱和二氢辣椒碱浓度范围为1～200 μg/mL时有良好的相关性。

2.2 辣椒碱和二氢辣椒碱标品液相色谱检测

辣椒碱和二氢辣椒碱的标准品液相色谱图见图1。其中保留时间为13.1 min的物质为辣椒碱，保留时间为18.5 min的物质为二氢辣椒碱。

图1 辣椒碱和二氢辣椒碱的标准品色谱图Fig.1 The chromatogram of capsaicin and dihydrocapsaicin standard samples

2.3 辣椒与大豆油的最佳料液比实验

将大豆油加热至170 ℃后，按辣椒粉∶大豆油为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7的比例，将油浇于辣椒粉上，充分混匀，静置于室温后，用保鲜膜覆盖，放于4 ℃冰箱待用。

取出辣椒油，经前处理后，使用液相得出的辣椒素类物质含量见图2。

图2 不同料液比下辣椒油中辣椒素类物质含量Fig.2 The content of capsaicinoids in chili oil under different solid-liquid ratios

由图2可知，随着料液比的增加，样品中辣椒素类物质总量呈减少的趋势，这可能是因为辣椒素易溶于油脂，在料液比为1∶3时就完全溶于油脂中，浓度达到最高，后续随着料液比的增加，油脂中辣椒素总量不变，溶剂的量增加，相当于稀释了辣椒素类物质的含量，故而其含量呈逐渐减少趋势。由于料液比为1∶3时，辣椒油的离心操作比较困难；料液比为1∶5时，油的用量增加，实验成本增加。故而本实验采用1∶4的料液比为最佳方案。

2.4 固相萃取条件的单因素实验结果

2.4.1 稀释剂用量对辣椒素类物质提取的影响

在淋洗剂正己烷用量为5 mL，洗脱剂甲醇用量为5 mL的条件下，不同稀释剂用量对辣椒油中辣椒素类物质提取的影响见图3。

图3 稀释剂用量对辣椒素类物质提取的影响Fig.3 The effect of diluent amount on the extraction of capsaicinoids

由图3可知，在稀释剂用量为2 mL时，辣椒素类物质的含量最多，为1.742 g/kg；而稀释剂用量为3，4，5，6，7 mL时，对辣椒素类物质含量的影响不显著。为了节省稀释剂用量，选择2，3，4，5 mL为固相萃取过程中稀释剂的用量范围。

2.4.2 洗脱剂种类对辣椒素类物质提取的影响

在稀释剂用量为2 mL，洗脱剂体积为5 mL时，洗脱剂种类对辣椒素类物质提取的影响见图4。

图4 洗脱剂种类对辣椒素类物质提取的影响Fig.4 The effect of eluent types on the extraction of capsaicinoids

在甲醇、异丙醇、乙腈和乙酸乙酯这4类洗脱剂中，甲醇和异丙醇对辣椒素类物质的提取量要远大于乙腈和乙酸乙酯，由于辣椒素类物质普遍带有羟基极性基团，可以与甲醇和异丙醇这类带有羟基极性基团的洗脱剂结合形成牢固的氢键，从而将辣椒素类物质从萃取柱上洗脱下来；而乙腈和乙酸乙酯由于不含有能与辣椒素类物质的羟基形成氢键的极性基团，故而不能与辣椒素类物质紧密结合，也就无法很好地将辣椒素类物质从萃取柱上洗脱下来，又因为作为极性溶剂，乙腈的极性比乙酸乙酯的极性大，所以乙腈的洗脱效率要大于乙酸乙酯。而在洗脱剂为10%、30%、50%、70%、90%甲醇-乙腈溶液的情况下，随着洗脱剂中甲醇浓度的升高，辣椒素类物质的提取量总体呈上升趋势，30%、50%、70%甲醇-乙腈溶液对辣椒素类物质的提取影响不显著，选取提取量相对较高的30%甲醇-乙腈溶液、90%甲醇-乙腈溶液、甲醇和异丙醇为固相萃取过程中洗脱剂的种类。

2.4.3 洗脱剂体积对辣椒素类物质提取的影响

在稀释剂用量为2 mL，洗脱剂种类为甲醇的条件下，洗脱剂体积对辣椒素类物质提取的影响见图5。

图5 洗脱剂体积对辣椒素类物质提取的影响Fig.5 The effect of eluent volume on extraction of capsaicinoids

在洗脱剂体积为0.5 mL时，辣椒素类物质的含量为0 g/kg，说明此时洗脱剂用量太少，无法将辣椒素类物质从萃取柱上洗脱下来；在洗脱剂用量为1，1.5，2 mL时，随着洗脱剂甲醇的体积增加，洗脱剂与萃取柱中辣椒素类物质的接触体积与接触时间逐渐增加，辣椒素类物质从萃取柱上转移至洗脱液中的量也逐渐增加，在洗脱剂体积为2 mL时达到峰值。故而选取洗脱剂体积为2，3，4，5 mL为固相萃取过程中洗脱剂的体积。

2.5 固相萃取条件的正交实验优化

正交实验结果见表2，方差分析见表3。固相萃取条件中影响辣椒素类物质提取的各因素主次为C(洗脱剂用量，mL)>B(洗脱剂种类)>A(正己烷用量，mL)，因素C的F值与极差R均大于因素A与因素B的值，说明洗脱剂用量对辣椒素类物质提取影响最大；F值与极差R最小的是因素A，说明在影响辣椒素类物质提取的因素中，稀释剂正己烷的用量影响最小。根据各主次因素的最高水平，得出的最优固相萃取提取辣椒素类物质的条件为A1B4C3，即稀释剂正己烷用量为2 mL，洗脱剂种类为90%甲醇-乙腈溶液，洗脱剂体积为4 mL为最优固相萃取提取辣椒油中辣椒素的条件组合。

表2 正交实验提取优化结果Table 2 The orthogonal experimental results for optimization of extraction process

表3 正交实验方差分析Table 3 The analysis of varlance of orthogonal experimental results

2.6 经固相萃取后的样品液相色谱检测

经固相萃取前处理后的辣椒油样品的色谱图见图6。

图6 经固相萃取后的辣椒油样品的色谱图Fig.6 The chromatogram of chili oil samples after solid-phase extraction

由图6可知，经过固相萃取后的样品没有明显的杂质峰，说明经过优化后的固相萃取前处理方法能很好地将油脂类杂质与辣椒素分离开来，增加辣椒素的检测精度，减少色谱柱的损耗。

2.7 优化后的固相萃取条件检验

2.7.1 加标回收率

用分析天平分别称取1 mg辣椒碱、1 mg二氢辣椒碱；10 mg辣椒碱、10 mg二氢辣椒碱；19 mg辣椒碱、19 mg二氢辣椒碱，分别加入2 g大豆油中，60 ℃水浴20 min，促进辣椒素类物质的溶解，之后用涡旋仪混匀，将充分混匀的样品经固相萃取(2 mL正己烷稀释，4 mL 90%甲醇-乙腈溶液洗脱)后，取全部洗脱液，用甲醇定容至100 mL，得低(辣椒碱和二氢辣椒碱均为10 μg/mL)、中(辣椒碱和二氢辣椒碱均为100 μg/mL)、高(辣椒碱和二氢辣椒碱均为190 μg/mL)3个浓度的分析物溶液，每个浓度平行测定3次，加标回收率实验结果见表4。

表4 加标回收率实验结果Table 4 The results of standard recovery rate experiments

由表4可知，辣椒碱的平均回收率在84.3%～98.6%，二氢辣椒碱的回收率在87.3%～97.7%，且中质量体积浓度与高质量体积浓度的样品的平均回收率要高于低质量体积浓度的样品，这可能是由于在低质量体积浓度下，辣椒碱和二氢辣椒碱所称取质量太少，称量工作的误差较大，导致低质量体积浓度的回收率较低。加标回收率实验的相对标准偏差(RSD)在0.1%～2.9%之间，说明该方法的准确性良好。

2.7.2 日内精密度和日间精密度

取低、中、高3个浓度的分析物溶液，重复进样3次，连续3 d，测定其日内精密度和日间精密度，结果见表5和表6。

表5 日内精密度和日间精密度回收率Table 5 The recovery rate of intra-day precision and inter-day precision

表6 日内精密度和日间精密度实验结果Table 6 The results of intra-day precision and inter-day precision experiments

由表6可知，辣椒碱的日内精密度实验结果RSD在0.2%～1.8%之间，日间精密度实验结果RSD在0.2%～0.4%之间；二氢辣椒碱的日内精密度实验结果RSD在0.2%～3.2%之间，日间精密度实验结果在0.2%～1.4%之间。说明经优化的固相萃取工艺精密度高，稳定性良好。

3 结论

固相萃取法作为一种近年来发展起来的样品预处理技术，可以有效地将分析物和干扰组分分离，从而减少样品的预处理过程，提高目标分析物的回收率[32]。通过使用NH2萃取小柱的固相萃取技术对从富含油脂的样品中提取分离辣椒素的前处理工艺进行优化，得出洗脱剂体积对辣椒素的提取分离影响最大，其次是洗脱剂种类和稀释剂体积。优化得到的固相萃取提取分离辣椒油中辣椒素的最佳工艺条件：在稀释剂正己烷体积为2 mL，洗脱剂种类为90%甲醇-乙腈溶液，洗脱剂体积为4 mL的条件下，辣椒素的提取率最高。通过加标回收率实验对固相萃取条件进行检验，辣椒素的回收率在84.3%～98.6%，RSD值在0.1%～2.9%之间；通过日内精密度和日间精密度实验，其RSD值在0.2%～3.2%之间，说明该法回收率高，精密度高，方法的稳定性好。用优化后的固相萃取技术对样品进行处理后，用HPLC检测样品，发现辣椒素物质的峰形良好，不同的辣椒素物质能很好地分离开来，且没有明显的杂质峰出现，说明样品经前处理后，油脂杂质能够很好地与辣椒素分离开来，这样既提高了辣椒素的检测精度，又大大减轻了油脂类杂质对色谱柱的损耗，可以延长色谱柱的使用寿命，降低实验成本。且对用HPLC检测辣椒素和HPLC-MS研究辣椒油中辣椒素的降解机理提供一个切实可行的样品前处理参考。