罗 韦 ，李 辉*，陈 林，叶 涛，肖 涛，黄锡阳，司宗贵，周 迪，张小玉

（1.高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州贵阳 550025；3.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025；4.贵州竹香鸡养殖有限公司，贵州遵义 564708；5.贵州省种畜禽种质测定中心，贵州贵阳 550025）

腱蛋白样蛋白1（Chordin-Like1，CHRDL1）基因位于鸡的4 号染色体上，是一种分泌性骨形态发生蛋白（BMPs）拮抗剂[1]。BMPs 是转化生长因子β（TGF-β）超家族中的一员[2]，其中BMP4 与诱导胚胎分化、指导神经干细胞分化密切相关[3]。研究发现，BMP4 在造血组织、皮肤附属物形成和分化以及肾脏、肝脏及神经系统发育中起一定的作用[4]，BMP4基因在小鼠卵巢组织中高表达，可促进原始卵泡的发育以及向初级卵泡转化[5]。在对鸡BMP4的基因结构与功能进行分析时发现，BMP4具有信号肽和潜在的糖基化、磷酸化位点，表明该生长因子在原始卵泡发育、早期胚胎发育中有着重要作用[6]。喻世刚等[7]研究发现，CHRDL1基因与沐川黑鸡肤色性状相关，且其SNP 位点c.-949T＞C 与肤色呈显著相关。目前，关于CHRDL1基因的研究鲜有报道。

赤水乌骨鸡主要分布于“楠竹之乡”赤水市，该鸡具有产绿壳蛋、耐粗饲、适应性强等特性[8]。绿壳蛋具有低胆固醇、低脂肪、富含硒和锌等特点[9]，受到越来越多的关注。陈林[10]对360 日龄赤水乌骨鸡蛋壳腺进行转录组测序分析发现，CHRDL1基因为蛋壳颜色深浅的下调基因，虽然已确定SLCO1B3基因为绿壳蛋的绿壳主效基因，在实际生产中尽管纯合子的绿壳蛋鸡都产绿壳蛋，但蛋壳的绿色程度深浅不一[11]。为探究CHRDL1基因对蛋壳绿色的影响，本研究检测不同产蛋期赤水乌骨鸡肝脏和蛋壳腺中CHRDL1基因的表达量，以丰富绿壳基因的研究结果，为赤水乌骨鸡的选育提供一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取180、360、540 日龄的赤水乌骨鸡母鸡各100 只，根据基因型和蛋壳颜色分为6 类：纯合型深绿色、纯合型浅绿色、纯合型淡绿色、杂合型深绿色、杂合型浅绿色、杂合型淡绿色。每种类型各个产蛋期随机选取3 只母鸡，共54 只，在其产蛋前2.5～3 h 屠宰，采集肝脏和蛋壳腺。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计 在GenBank 中检索到CHRDL1基因和SLCO1B3基因的mRNA 序列分别是NM_204171.1和NM_001318449.1，利用Primer Premier 5 进行引物设计，引物由贵阳春满谷生物科技有限公司合成，具体信息见表1。

表1 引物信息

1.2.2 绿壳基因分型 采集180、360、540 日龄赤水乌骨鸡母鸡各100 只血液2～3 mL，翅下采血，EDTA 抗凝，使用血液基因组DNA 提取试剂盒（购自北京天根生化科技有限公司）提取血样中的DNA，采用双重PCR 对SLCO1B3基因进行分型，分为绿壳纯合型、绿壳杂合型和纯合非绿壳。双重PCR 反应体系为（20 µL）：Taq PCR Mastermix（购自北京天根生化科技有限公司）10 μL（0.1 U/µL），上下游引物各 1 µL（10 µmol/L），DNA 模板1 µL（200 ng/µL），加ddH2O 补足20 µL。反应程序：94℃预变性5 min，35 个循环（94℃变性30 s、51.3℃退火40 s、72℃延伸40 s），72℃延伸10 min，4℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物，在凝胶成像系统下观察基因型。

连续7 d 观察各日龄纯合型和杂合型母鸡每天所产蛋的颜色，将产蛋颜色均匀的母鸡做好标记，并收集180 日龄纯合型和杂合型产蛋颜色均匀的母鸡所产的蛋，测其蛋壳中胆绿素的含量，并按照蛋壳中胆绿素含量的高低将绿壳蛋分为深绿色、浅绿色、淡绿色，并以此作为实验动物分类的参照，结合基因型和蛋壳颜色将实验动物分为纯合型深绿色、纯合型浅绿色、纯合型淡绿色、杂合型深绿色、杂合型浅绿色、杂合型淡绿色6 类。

蛋壳胆绿素测定方法参考刘敬寿[12]和卜小雁[13]的方法。称取原卟啉36 mg、胆绿素26 mg 溶解于6 mL溶剂中，溶剂由浓盐酸和甲醇按1:2 的比例配制而成，漩涡振荡，避光保存18 h，分别制成原卟啉和胆绿素的标准原液[11]。将原液稀释成8、16、32、64、128、256、512 倍，利用紫外分光光度计分别测定在412 nm和680 nm 处蛋壳溶解液的吸光值[12]。测定不同绿色深浅蛋壳中胆绿素含量时发现，胆绿素含量越高其蛋壳绿色越深。周玉[14]研究发现，可以采用NR 型蛋壳颜色色差计测量蛋壳颜色，不同绿色深浅的蛋壳其数值不同，蛋壳绿色越深其数值越小。

1.2.3 RNA 的提取 采集不同产蛋期的赤水乌骨鸡的蛋壳腺和肝脏，采用Trizol 法提取组织样的总RNA，经紫外分光光度计检测，OD260/OD280的比值介于1.9～2.1之间，平均浓度达到3 000 ng/µL，具体步骤按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 实时荧光定量PCR 扩增体系及程序 为测定不同产蛋期的赤水乌骨鸡蛋壳腺和肝脏中CHRDL1基因的表达量，本实验采用实时荧光定量PCR 的方法测定，反应体系采用20 µL 体系：SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）10 µL（1 x），上下游引物各0.6 µL（10 µmol/L），cDNA 1 µL（1 000 ng/µL），ddH2O 7.8 µL；反应条件按照SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）说明书进行。

1.2.5 统计分析 运用SPSS 22.0 软件对本实验所有数据进行统计和分析，并进行t检验。表中数据均用平均数±标准差表示，以P＜0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1SLCO1B3基因PCR 扩增结果 检测结果如图1 所示，绿壳纯合子（SL/SL）产物片段大小为884 bp，绿壳杂合子（SL/W）产物片段大小为884 bp 和732 bp，非绿壳纯合子（W/W）产物片段大小为732 bp。3 种基因型的凝胶电泳产物片段大小与目的片段大小一致，表明该分型结果可以用于赤水乌骨鸡的基因分型。

图1 SLCO1B3 基因PCR 扩增结果图

2.2 蛋壳胆绿素含量分析 由表2 可知，180 日龄时，基因型相同时，深绿色的蛋壳胆绿素含量极显著高于浅绿色及淡绿色，浅绿色的蛋壳胆绿素含量极显著高于淡绿色。相同蛋壳颜色的情况下，纯合型与杂合型间胆绿素含量不存在显著差异，但是纯合型的蛋壳胆绿素含量略高于杂合型。对CHRDL1基因的表达量与蛋壳中胆绿素含量进行相关系数计算，结果显示相关系数为-0.888 3，呈极显著负相关。

表2 180 日龄不同绿色蛋壳的胆绿素含量

2.3CHRDL1基因的差异表达分析

2.3.1 赤水乌骨鸡蛋壳腺中CHRDL1基因的表达情况CHRDL1基因在蛋壳腺中不同颜色间的表达情况如表3所示，180 日龄时，纯合型的情况下，深绿色极显著低于淡绿色，浅绿色与其他两者之间无显著差异，杂合型的情况下，深绿色极显著低于浅绿色，浅绿色极显著低于淡绿色；360 日龄时，纯合型的情况下，深绿色和浅绿色间不存在显著差异，深绿色和浅绿色均极显著低于淡绿色，杂合型的情况下，深绿色极显著低于浅绿色，浅绿色极显著低于淡绿色；540 日龄时，纯合型的情况下，深绿色极显著低于浅绿色和淡绿色，浅绿色和淡绿色间不存在显著性差异，杂合型的情况下，深绿色和浅绿色间不存在显著差异，均极显著低于淡绿色。

当蛋壳颜色相同时，CHRDL1基因在不同基因型的赤水乌骨鸡蛋壳腺中的表达情况为：180 日龄、360日龄和540 日龄时，都表现为在淡绿色蛋壳的情况下，纯合型极显著低于杂合型，其他蛋壳颜色情况下纯合型与杂合型间不存在显著性差异。

表3 CHRDL1 基因在蛋壳腺中的表达情况

如图2 所示，CHRDL1基因在不同日龄的赤水乌骨鸡蛋壳腺中的表达量不存在显著差异。

图2 不同日龄的赤水乌骨鸡蛋壳腺中CHRDL1 基因的差异表达

2.3.2CHRDL1基因在肝脏中表达量的情况 由表4 可知，同一产蛋期CHRDL1基因在纯合型赤水乌骨鸡肝脏中的表达情况为深绿色极显著低于浅绿色和淡绿色，180 日龄时淡绿色与浅绿色间不存在显著差异；在杂合型赤水乌骨鸡肝脏中的表达情况为深绿色极显著低于浅绿色和淡绿色，浅绿色极显著低于淡绿色。

表4 CHRDL1 基因在肝脏中的表达情况

在蛋壳颜色相同时，CHRDL1基因在不同基因型的赤水乌骨鸡肝脏中的表达情况为：180 日龄、360 日龄和540 日龄时，都表现为在淡绿色蛋壳的情况下，纯合型中的表达量极显著低于杂合型，540 日龄浅绿色情况下，纯合型中的表达量显著低于杂合型，其他蛋壳颜色情况下不存在显著性差异。

不同日龄的赤水乌骨鸡肝脏中CHRDL1基因的差异表达情况如图3 所示，纯合型深绿色、纯合型浅绿色的条件下，180 日龄和540 日龄的赤水乌骨鸡肝脏中CHRDL1基因的表达量显著低于360 日龄，纯合型淡绿色的情况下，180 日龄和540 日龄极显著低于180 日龄；杂合型淡绿色的条件下180 日龄和540 日龄显著低于360 日龄，其余情况下不同日龄的赤水乌骨鸡肝脏中CHRDL1基因的表达量不存在显著性差异。

图3 不同日龄的赤水乌骨鸡肝脏中CHRDL1 基因的差异表达

3 讨 论

本实验发现，随着蛋壳绿色的加深，CHRDL1基因的表达量降低，与转录组测序和相关分析的结果一致，认为CHRDL1基因可能是影响蛋壳绿色深浅的微效基因。目前对CHRDL1基因的功能及分子调控机制的研究较少。本实验发现CHRDL1基因的表达量与蛋壳绿色深浅存在规律性，因此推测CHRDL1基因可能与绿壳蛋的蛋壳色素沉积有关，将会对其进一步研究。

相关研究表明蛋壳胆绿素是在肝脏中合成并由壳腺部分泌的[14]，360 日龄为产蛋的高峰期，此时肝脏中色素合成的速度加快[15]。本次实验发现，360 日龄的赤水乌骨鸡肝脏中CHRDL1基因的表达量高于180 日龄和540 日龄，因此推测CHRDL1基因可能与色素的合成有关。

相关研究表明蛋壳色素有壳腺部合成和血液中合成2 种途径[15]，Polin[16]研究发现子宫组织合成卟啉量为肝组织的2 倍，且不随组织重量的增加而变化；Li 等[17]采用荧光定量PCR 对产深浅褐壳蛋母鸡肝脏及蛋壳腺的基因表达量进行研究，发现卟啉-Ⅸ在蛋壳腺中合成。原卟啉和胆绿素是2 种主要的蛋壳色素[18]。本实验采集360 日龄赤水乌骨鸡的蛋壳腺做了转录组测序分析，发现CHRDL1基因为蛋壳绿色的下调基因[10]，为了验证转录组测序的结果，本实验利用qPCR 技术检测了CHRDL1基因在不同产蛋期的赤水乌骨鸡肝脏和蛋壳腺中的表达量，验证了CHRDL1基因为蛋壳绿色的下调基因这一测序结果。

4 结 论

本实验结果显示，CHRDL1基因在赤水乌骨鸡肝脏和蛋壳腺中的表达量表现为杂合子的表达量高于纯合子，在不同基因型都表现为随蛋壳颜色变深CHRDL1基因的表达量降低，与本课题组前期转录组测序的结果显示CHRDL1基因为负调控基因相符合，并且与本研究相关分析结果显示的CHRDL1基因表达量与蛋壳胆绿素含量呈极显著负相关一致。推测该基因可能为蛋壳颜色的负调控基因，其作用机理有待进一步研究。