MSI在结直肠癌中的应用研究新进展

2020-12-20杨镜玉李文亮

昆明医科大学学报 2020年4期

杨镜玉，李文亮

（昆明医科大学第一附属医院肿瘤科，云南昆明 650032）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）为世界上最常见的癌症之一，据研究报道：CRC在2018年有近200万新发病例和100万死亡病例，为全球癌症死亡的第三大原因之一[1-2]；预计到2030年，该病在全球将进一步增加60%[3]。CRC根据分子变化可分为三大类：（1）染色体不稳定型（chromosomal Instability，CIN）；（2）微卫星不稳定型（microsatellite instability，MSI）；（3）CpG岛甲基化表型（CpG Island Methylator phenotype，CIMP）。大约75%的CRC与染色体不稳定性（CIN）改变有关，而MSI在所有CRC病例中占10%～20%，包括12%散发性结直肠癌（sporadic colorectal cancer，SCRC）和3%遗传性非息肉病性结直肠癌（hereditarynon-polyposis colorectal cancer，HNPCC，Lynch综合征）[4-6]。几项研究估计大约25%的CRC病例是家族性的，不遵循经典的孟德尔遗传模式[6-7]。近几年来，科学家们发现结直肠癌是一种多生物学和遗传学特征性的异质性疾病，在临床表现、预后和个体治疗反应，甚至在同一病理阶段都存在显著差异，不通过识别其分子和遗传特征很难诊断和治疗[8]。

随着研究深入，MSI作为CRC及其他实体瘤的重要基因标志物，被公认是结直肠癌的重要致癌途径之一，在CRC的筛查、分类、诊断、治疗和预后的应用中具有重要临床意义，已经越来越受到关注，并成为临床热点。本文将综述MSI及其与结直肠癌（遗传性和散发性肿瘤）的关系，并着重要对MMR和MSI检测的分子技术及相关免疫检查点抑制剂（ICPIs）的免疫治疗的新进展进行综述。

1 微卫星不稳定性

微卫星（microsatellite，MS），又称为短串联重复序列（short tandem repeats，STRs），是指散布在整个基因组中以少数几个核苷酸（1-6个碱基对）为单位串联重复的DNA序列，约占人类基因组的3%。由于MS的重复结构，它特别容易发生复制错误，而正常情况下由DNA错配修复系统（mismatchrepair，MMR）进行修复[9]。

错配修复（MMR）系统旨在纠正DNA复制和重组过程中产生的错误插入、缺失和碱基错配，这种修复途径高度保守，借此保护基因组的完整性。MutS和MutL是MMR系统中涉及的主要蛋白质。MSH2、MSH3和MSH6是MutS的同源物；MLH1，MLH2，MLH3是MutL的同源物，MutL减数分裂后形成同源物PMS1和PMS2[10]。当在真核基因组中检测到错配时，MSH2与MSH6或MSH3结合，分别导致MutSα 和MutSβ异二聚体的形成。MutSα 识别单碱基错配和小插入/ 缺失环，而MutSβ识别更大的环。MutSα 或MutSβ可以通过将腺苷三磷酸（adenosinetriphosphate，ATP）与二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）交换来募集MutLα，MutLβ或MutLγ 异二聚体（如果MLH1分别与PMS2，PMS1或MLH3偶联）。这种复合物（MutS-MutL）在DNA周围产生滑动钳。滑动钳中的蛋白质与外切核酸酶-1和增殖细胞核抗原（PCNA）相互作用，这种复合物将子链切除。最后，分别通过DNA聚合酶和DNA连接酶进行重新合成和重新连接，以达到修复错配蛋白缺失[11-12]。MMR功能缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）时，MS出现的复制错误得不到纠正并不断累积，使得MS序列长度或碱基组发生改变，称为微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）。MSI肿瘤DNA中的被定义为存在相应的种系DNA中不存在的交替大小的重复DNA序列[13]。

MSI由DNA错配修复（MMR）蛋白功能缺陷导致。最近研究证明MSI参与许多遗传型和散发型肿瘤的发病机制，包括结直肠癌、头颈部鳞癌、非小细胞肺癌、鳞状基底细胞皮肤癌、黑色素瘤、胃、膀胱、子宫内膜和卵巢癌[14]。因此，测定CRC中MSI状态对诊断、分类、预后和治疗具有重要临床意义，越来越受到重视。

2 微卫星不稳定性相关结直肠癌

MSI是公认的结直肠癌的重要致癌途径之一，其在所有CRC病例中占10%～20%，包括12%散发性结直肠癌（sCRC）和3%遗传性非息肉病性结直肠癌（hereditary non-polyposis colorectal cancer，HNPCC），即Lynch综合征[15]。因而，开展对MSI相关CRC（MSI型CRC）筛查、识别、治疗和预后的研究具有重要的临床应用意义。

2.1 散发性结直肠癌

散发性结直肠癌（Sporadic colorectal cancer，sCRC）约占MSI在所有CRC病例中的12%，称为MSI型sCRC。它最常见的原因是体细胞启动子超甲基化导致MLH1基因的表观遗传失活（约70%～95%），而MSH2和MSH6的改变较少见[16]。与Lynch综合征不同，MSI型sCRC在大约50%的病例中与BRAFV600E突变相关[17]。大约5%～15%的CRC肿瘤中可诊断出来BRAF突变，且目前认为BRAF突变是一个预后较差的生物标志物。BRAF突变发生率可能因肿瘤分期不同而不同。有报告表明，在dMMR型sCRC中，转移性结直肠癌与早期结直肠癌相比，BRAF突变的发生率更高（34.6%vs 24%）[17]。根据MSI/MMR、KRAS和BRAF状态的不同，不同亚型的大肠癌预后可能不同[18]。与转移性CRC相比，II期CRC的MSI发生频率更高[19]。

MSI型sCRC的临床病理特征包括好发于右半结肠和女性患者，粘液或髓样组织学表现，肿瘤浸润性淋巴细胞和克罗恩样肉芽肿，以及比CIN癌更好的分期及预后[20]。MSI很少是散发性直肠癌的主要途径，因此当这种结合发生时，通常与Lynch综合征有关。

MSI状态在所有阶段的CRC中都是一个重要的预后因素[21]。据Mohan等[22]的一项单中心研究表明，该研究回顾了1 250名CRC患者，与MSS型CRC相比，MSI型CRC患者在I期和II期疾病中的无病生存率（diseasefreesurvival，DFS）有所改善。然而，在III期中，MSI型CRC的特征是更突出的淋巴血管周围浸润和神经周围浸润，并且这个亚组的DFS比III期的MSS型CRC患者短。根据Kim等人的研究结果表明，微卫星高度不稳定型（MSI-high，MSI-H）CRC患者比 MSI-L型（MSI-low，MSI-L）或 MSS型（microsatellite stability，MSS）CRC患者有更长的DFS（HR0.619（95%CI:0.508～0.755，P＜0.001），更容易出现局部复发（30.0%vs 12.0%，P=0.032）或腹膜转移（40.0%vs 12.3%，P=0.003），而腹外复发比MSI-L或MSS型CRC少（肝转移44.7%vs 15.0%，P=0.004）；肺转移42.5%vs 10.0%，P=0.004））[23]。

2.2 Lynch综合征（LS）

在所有新发的结直肠癌病例中，其中3%可归因于Lynch综合征（lynch syndrome，LS）[24]。LS旧称遗传性非息肉性结直肠癌（hereditary non-polyposis colorectal cancer，HNPCC），是最常见的遗传性结肠癌综合征，是一种常染色体显性遗传疾病，由几种MMR基因（包括染色体2p16上的MSH2，染色体3p21上的MLH1，染色体2p16上的MSH6和染色体7p22上的PSM2）之一发生杂合性致病性胚系突变所致，或由EPCAM基因缺失导致MSH2不表达所致[25]。由于MMR基因功能缺陷，LS患者常表现为错配修复功能缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）或微卫星高度不稳定性（MSI-High，MSI-H）。目前认为[26]，当一个错配修复基因发生胚系突变时，极有可能引起该基因在另一个拷贝中发生“二次打击”即发生体细胞突变，从而致癌，即“二次打击”学说。该学说认为[26]，遗传性肿瘤第一次突变发生于生殖细胞，第二次突变发生于体细胞。而散发性肿瘤两次突变均发生于体细胞。因此“二次打击”学说[26]解释了遗传性肿瘤表现出早发性、多发性、双侧性的特征，而散发性肿瘤则表现出迟发性、单发性、单侧性特征。

LS患者与sCRC患者相比，LS发病年龄更早（45～60岁vs.69岁）[27]。虽然结直肠癌是与Lynch综合征相关的最常见的癌症，但也可以发生肠外癌症，包括子宫内膜癌（最常见）、小肠癌、输尿管癌、肾盂癌、胃癌、肝胆管癌和卵巢癌[28]。LS临床特征包括：早期，同时或异时性CRC，右侧结肠癌占主导。多表现为低分化，黏液性，髓样生长[29]。

LS患者肿瘤间质有大量淋巴细胞浸润，提示对高突变负荷产生了相应的免疫反应。高突变是由MMR功能缺失导致错配的碱基得不到修复进而积累，这反过来又提供了高度的免疫原性，提高了免疫治疗的反应性[17]。dMMR型CRC与错配修复功能完整（proficient mismatch repair，pMMR）的CRC相比，具有早期诊断和较低的转移倾向的特征。dMMR型CRC的发病率在II期为20%，在III期中为11%，在IV期为3.5%[30]。多项研究[31]显示，非转移性dMMR型CRC患者的预后明显好于同分期的pMMR型CRC患者。在复发或转移性的CRC患者中，dMMR型CRC患者的预后与pMMR型CRC患者相似或更差，这一发现仍未得到解释[32]。

MMR蛋白/MSI的检测可对LS进行初筛。LS诊断包括：鉴定错配修复基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）胚系突变或EpCAM（上皮细胞粘附分子）胚系缺失（导致MSH2失活）。据报道，MLH1或MSH2突变占Lynch相关癌症的60%～80%，剩下则多归因于MSH6或PMS2突变，EpCAM突变非常罕见[33]。MSH2突变与肠外恶性肿瘤，尤其是与子宫内膜癌高风险相关。而MSH6突变携带者患肠癌或肠外癌的年龄晚于MLH1或MSH2突变的患者[34]。MLH1和PMS2表达缺失，说明MLH1启动子发生体细胞甲基化（常发生于sCRC）或MLH1胚系突变（LS-CRC）；MSH2和或MSH6或PMS2缺失通常由胚系突变引起。免疫组化测定结果与MSI测定显示出高度一致性[35]。当发现错配修复蛋白缺失或MSI时，继续行BRAFV600E测试或MLH1甲基化分析，体细胞BRAFV600E突变与MLH1甲基化相关，在胚系突变中未观察到[36]。值得注意的是，MMR蛋白/MSI的检测作为初筛手段有可能漏诊部分LS。一方面原因是MMR蛋白/MSI的检测对LS的敏感度分别为83%和77%～89%，存在一定漏诊率[37]；另一方面，LS不仅表现为首发结直肠癌，也有相当部分患者首发肿瘤为肠外肿瘤，因此仅对结直肠癌患者进行MMR蛋白/MSI的筛查也是漏诊的重要原因[38]。

3 微卫星不稳定性检测方法

MSI多由MMR蛋白表达缺失所致。因此，可通过检测MMR蛋白或MSI来反映微卫星状态。通过IHC法检测MMR蛋白和通过PCR法检测MSI是评估相同生物学效应的不同检测方法。一般而言，dMMR相当于MSI-H表型，pMMR相当于MSI-L/MSS表型[39]。

3.1 IHC检测法

IHC法检测MMR蛋白是一种间接评估微卫星状态的方法。IHC法就检测4个常见MMR蛋白（MLH1，MSH2，PMS2和MSH6）的抗体表达，阳性表达定位于细胞核。如果任何一个蛋白表达缺失，即定义为错配修复功能缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）；如果4个蛋白表达均为阳性，即定义为错配修复功能完整（proficient mismatch repair，pMMR）。IHC检测应强调标本处理规范，采用自动判读与人工判读相结合。人工判读易受主观因素影响[39]。

3.2 PCR检测法

直接检测MSI状态的常用方法是多重荧光PCR毛细血管电泳法，这也是目前认可的金标准。PCR法是从人的肿瘤组织样本的几个微卫星位点扩增DNA，与来自每位患者的正常DNA进行比较。目前推荐的5个微卫星（MS）检测位点（BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250）。判断标准分为三级：2个及2个以上位点不稳定为微卫星高度不稳定（MSI-high，MSI-H）；1个位点不稳定为微卫星低度不稳定（MSI-low，MSI-L）；如果所有5个位点均稳定为微卫星稳定（MSS）[39]。

3.3 二代测序（nextgenerationsequencing，NGS）法

近年来，随着测序技术的发展，欧洲肿瘤内科学会（european societyfor medical oncology，ESMO）指南推荐将NGS作为MSI的二线检测方法。MSI检测可通过经验证的NGSpanel进行，其优势在于还可覆盖检测其它多基因突变状态，如KRAS、BRAF等。目前已报道的基于NGS的MSI检测包括：MSIsensor[40]、MANTIS[41]、mSINGS[42]、MSI-ColonCore[43]。其中中国团队研发的MSI-ColonCore，与PCR毛细管电泳法一致性为99%，与IHC法一致性为92.4%。该实验招募了91例原发性结直肠癌患者，其中54例患者经IHC法检测术后病灶组织判为dMMR，另37例判为pMMR。从肿瘤组织中提取DNA，分别用NGS和PCR毛细管电泳法评估微卫星状态。该实验研究表明，MSI-ColonCore检测的灵敏度可达97.9%（47/48），特异度达100%（37/37）。MSI-ColonCore利用一组特定的重复长度的覆盖率作为每个微卫星基因座的主要特征，如果覆盖率小于给定的阈值，则判读为微卫星不稳定。样品的MSI状态由给定样品中不稳定基因座的百分比确定[43]。随着NGS技术的发展，基于MSI-NGS分析的优势越来越凸显。相较于IHC法及PCR毛细管电泳法存在人工判读结果带来的主观差异，NGS数值量化结果更加客观，更有利于检出分析低频的MSI；其次，相较于PCR法需要正常组织作为对照，NGS法构建DNA文库可参考人类全基因组公开数据结果，且一旦验证完成投入检测未知样本，并不需要匹配正常组织作为对照；其三，NGS测序可同时捕获CRC患者的突变谱和MSI状态，从而减少所需的组织样本量并简化测试过程。这将有利于无法耐受手术的患者，尤其是大多数转移癌患者[42]。随着NGS技术不断成熟，利用NGS测定基于外周血循环DNA（circulatingtumorDNA，ctDNA）的MSI检测（MSIfromblood，b-MSI）也成为可能，如上海瑞金医院开展的运用NGS测序检测MSI在大肠癌患者血液中的运用（NCT03561350），主要研究目标即通过检测晚期CRC患者血液标本中的循环肿瘤ctDNA，来评价NGS方法检测b-MSI的可行性和可靠性。b-MSI检测有望对取材困难的晚期肿瘤患者提供新的选择。

4 治疗与预后

当前，对于CRC的治疗提倡综合治疗，包括手术、靶向治疗、新辅助治疗、辅助化疗等。耐药性依然是导致晚期CRC患者低存活率的主要原因[44]。肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）对于CRC治疗的影响已引起学界广泛关注，TME为结直肠癌细胞提供了存活、生长、免疫逃避及转移的环境[45]。评估免疫细胞状态及浸润情况也作为预后评估及预测的重要指标。

近几年来，以免疫检查点抑制剂（immune check-point inhibitors，ICPIs）为代表的免疫治疗在抗癌方面取得了长足进步。ICPIs是一类具有释放免疫系统潜力的新型免疫治疗药物。虽然大多数胃肠道癌症被认为免疫原性差，但基础研究及临床试验数据已经证明，各种胃肠道癌患者的亚群对ICPIs在内的治疗具有很高的反应性[46]。目前为止，MSI-H的结直肠癌患者依然是对当前ICPIs有反应的唯一亚组[44]。研究发现MSI肿瘤有大量的淋巴细胞浸润，称为肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）。丰富的CD3+和CD8+细胞毒性TIL在宿主中触发免疫反应，导致一个称为“免疫编辑”的过程，是产生免疫耐受，免疫逃逸的重要原因。一系列检查点抑制剂调节该免疫编辑过程，包括程序性死亡受体-1（programmed death-1，PD-1）、程序性死亡受体配体-1（programmed death lig and-1，PD-L1）以及细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cyto-toxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）等[47]。有研究表明，MSI肿瘤的突变负荷或新抗原比MSS肿瘤高出20倍以上，从而导致这些“超突变”表型的对免疫治疗反应性增强。MSI肿瘤与MSS肿瘤相比，MSI肿瘤中的TIL上PD-1的表达率（77%vs 39%）和肿瘤细胞上PD-L1的表达率（32%vs 13%）明显增高[48]。在使用派姆单抗（Pembrolizumab，抗PD-1）治疗MSI-H患者的II期临床实验中，观察到总缓解率（objective response，OR）、疾病稳定（stable disease，SD）、无进展生存期（progression-free survival，PFS）均上升。同样的，当用纳武单抗（Nivolumab，抗PD-L1）治疗MSI-H患者，也观察到明显益处[49]。对于ICPIs治疗没有取得满意疗效的肿瘤，越来越多研究[50]建议ICPIs与化疗或靶向治疗相结合。目前普遍认为，化疗或靶向治疗可以增加肿瘤的免疫原性[50]。Howard等[51]开展的Ib期临床研究（NCT01633970）证实MSI-H型mCRC患者接受Atezolizumab+Bevacizumab治疗后，疾病控制率为90%。这种组合的耐受性很好，且没有意外的毒性发生。除了联用贝伐珠单抗外，几种免疫治疗联合靶向治疗的相关研究也在招募进行中，有望取得更多突破。

尽管ICIPs治疗在MSI-HCRC患者中取得了显著疗效，但MSI的存在仅占CRC病例的15%，而MSI-H的发生率占5.9%甚至更低[52]。所以，绝大多数患者不在ICPIs临床获益范围内。Bendall等[53]进行了一项1b期试验，使用PDL-1抑制剂Atezolizumab和Cobimetinib（MEK途径抑制剂）联合治疗转移性MSS型CRC，联合用药方案在23名患者中的客观反应率（ORR）为17%。22例KRAS突变型肿瘤患者的ORR为20%。6个月OS率为72%。Ebert研究团队[54]设计使用MEK抑制剂G-38963抑制MEK并联合使用PD-1抑制剂，实验观察到更长期的存活率，而单一用药仅表现出肿瘤生长的初始延迟。实验还观察到，MEK抑制剂可作用于T细胞分化的幼稚阶段，MEK抑制剂可抑制CD8+T细胞表达Nur77，Nur77与T细胞死亡有关，抑制Nur77表达，可挽救T细胞衰竭。协同使用PD-1/PD-L1抑制剂可使pMMR患者获益，目前已在III期临床实验（NCT02788279）中进行评估。这种针对MSS肿瘤，联合MEK抑制剂和PD-1/PD-L1抑制剂协同治疗，为ICPIs治疗开辟新的途径，并有望长期获益。可以预见，未来免疫治疗仍是最热门的治疗手段之一。未来研究热点方向包括：（1）筛选寻找合适的免疫检查点抑制剂的生物标记；（2）寻找合适的联合用药方案，以规避单药治疗弊端等，以期在实体肿瘤中获得长足进步。