王 礴，夏咸松，李进涛，段小花

（1）云南中医药大学教务处；2）昆明医科大学实验动物学部；3）云南中医药大学民族医药学院，云南昆明 650500）

全球流行病学调查研究结果显示非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）发病率逐年升高，已经成为全世界范围内最常见的肝病，其在正常人群中发病率约为20%～50%，在肥胖人群或高血脂人群中高达90%，其发生率远超病毒性肝炎或酒精性肝病[1]，在所有发生率中，以西方发过国家最高，其患病率高达28%到45%之间，而在包括我国在内的发展中国家发生率约为10%～25%之间[2]。在上述NAFLD患者中，约有15%的患者可进一步发展为非酒精性脂肪性肝炎，3%的患者可发展为肝硬化甚至肝癌[3]，因此研究和关注NAFLD势在必行。甘草甜素是中药甘草的主要药理活性成分之一，其具有明显的抗氧化和消炎作用，此外其在保肝方面有较多文献报道[4-5]，但是关于其治疗NAFLD动物研究还没有文献报道。为此本研究采用高脂饮食构建NAFLD大鼠模型，采用甘草甜素治疗，观察治疗后大鼠肝功能、血脂以及抗氧化指标的变化特点，旨在探讨甘草甜素对NAFLD的治疗作用，并从细胞素色P450 2E1（cytochromeP450 2E1，CYP2E1）蛋白分析其治疗的潜在作用机制，以为中药甘草的开发和NAFLD的治疗提供基础理论数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 大鼠购于昆明医科大学动物实验中心，（许可证号：SYXK[云]2015-0004），大鼠品级为SPF级，5～6周龄、雄性，70只，体重位于180～200 g之间。购买后饲养于云南中医药大学科研中心动物实验部。由专业人员统一饲养于管理，光照/黑暗=12 h/12 h。

1.1.2 主要试剂（1）甘草甜素（98%，食用级）购自南京源植生物科技有限公司；（2）多烯磷脂酰胆碱购于赛诺菲（北京）制药有限公司；（3）谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）试剂盒购于南京建成生物工程研究所；（4）丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及谷胱甘肽酶（glutathionease，GSH）测定试剂盒购于武汉华美生物科技有限公司；（5）PVDF膜购于美国Millipore公司；（6）GAPDH抗体和细胞素色P450 2E1（cytochromeP450 2E1，CYP2E1）购于美国Santa公司；（7）引物购于武汉塞维尔生物科技公司。

1.2 动物模型构建及样本采集

1.2.1 NAFLD大鼠模型建立 本研究所有动物实验均经云南中医药大学伦理委员会批准，在购买后先给予适应性喂养1周，后按照随机数字法分组，将大鼠分为正常组以及实验组，其中正常组12只，模型组58只，正常组给予普通饲料喂养，模型组则给予高脂饲料喂养，喂养8周后，正常组随机选取2只、模型组随机选取8只，处死收集肝脏观察肝脏病理学结果判断造模是否成功，造模成功的标准为组织病理学上有1/3以上肝细胞脂变。

模型构建成功后再次后按照随机数字法将实验组大鼠分组，分为5个实验组，分为为模型组、多烯磷脂酰胆碱组、甘草甜素低、中和高剂量组，每组10只，分组后立即给予相应治疗，治疗时，正常组和模型组每日给予0.9%生理盐水灌胃，多烯磷脂酰胆碱组每日给予多烯磷脂酰胆碱23 mg/kg灌胃，甘草甜素低、中和高剂量组则每日给予甘草甜素2 mg/kg、4 mg/kg和8 mg/kg灌胃，灌胃时间固定为每日早上9点至10点，共治疗6周。

整个实验期中，正常组大鼠饮食正常，毛色发亮整洁，活动和精神状态均良好，相较于正常组，模型组精神和活动量在造模第6周就开始明显减少，但体重增加明显，毛色相对发黄，粪便发臭。几个治疗组相较于模型组精神状态有一定改善，毛色和粪便发臭情况明显改善。此外在整个实验期中，实验期间各组大鼠均无死亡。

1.2.2 样本收集方法 6周后，将大鼠用戊巴比妥钠麻醉后固定于解剖版，腹主动脉取血法收集血液样本4℃条件下3 000 r/min，离心10 min，以分离血清，血清收集后储存于超低温冰箱中。后取出肝脏，切取肝小叶0.5 cm左右置入4%的组织固定液中保存用于组织病理学检测，其余组织置入超低温冰箱中保存备用。

1.3 观察与检测指标

1.3.1 一般指标观察 在整个实验期中每天均监测各组大鼠的摄食量、饮水量变化，同时每周称重一次大鼠，观察大鼠精神以及行为状态。

1.3.2 血清生化指标检测 血清生化指标的检测按照试剂盒提供的说明书进行。

1.3.3 HE染色观察肝组织病理学 从组织固定液中取出肝脏组织，自来水反复冲洗后采用乙醇逐级脱水、二甲苯透明、浸蜡后石蜡包埋，切片即可，切成3～5μm左右的薄片后采用常规方法[6]对组织进行HE染色即可，完成后采用光学显微镜收图像，每张图片选取4个不同的视野。

1.3.4 WesternBlot检测肝脏CYP2E1蛋白表达称取1 g肝脏组织，用组织裂解液裂解后，采用总蛋白提取试剂盒收集总蛋白，总蛋白收集后定量调平，每组各取50μg行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SD-PAGE），电泳完成后将目的蛋白转移到PVDF膜，后采用1抗（CYP2E1为1:3 000；GAPDH为1:5 000）封闭过夜，二抗（1:5 000）孵育后，最后采用电化学发光用凝胶成像分析系统各个条带的光密度值即可，结果以CYP2E1/GAPDH的光密度值比较。

1.3.5 实时荧光定量检测肝脏中CYP2E1mRNA表达 称取20μg肝脏组织，用总RNA提取试剂盒提取总RNA后，使用荧光定量PCR仪上将其逆转录为cDNA，逆转录完成后每组各取1μg行PCR循环，条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，63 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最终反应完成后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存即可。每份样品做3次重复，结果采用2-△△Ct法比较分析，引物由武汉塞维尔生物设计并合成，具体为CYP2E1上游：TGCGGAGGTTTTCCCTAAGTA，下游：TGTGCCTCTCTTTGG-ATGCG，产物长度为为82；GAPDH上游：AGGTCGGTGTGAACGGATTT G,下游 ：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA，产物长度为123。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠肝脏病理学

大鼠肝脏病理学HE检测结果，正常对照组肝脏组织结构完整，可清晰看到分布均匀的细胞核结构，相较于正常组，模型组出现明显的肝小叶结构破坏，同时肝细胞核肿胀，脂肪空泡浸润等，与模型组相比，多烯磷脂酰胆碱组和甘草甜素组均有明细的改善，见图1。

图1 大鼠肝脏病理学HE检测结果（×400）Fig.1 HE staining results of rat liver pathology（×400）

2.2 对大鼠肝功能指标AST和ALT的影响

与正常组相比，模型组大鼠血清中肝功能指标ALT和AST含量明显增加，且差异具有统计学意义（P＜0.05），经甘草甜素干预后，ALT和AST均降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 甘草甜素治疗后各组大鼠肝功能比较［n=10，（）］Tab.1 The comparison of liver function in different groups after Glycyrrhizin treatment ［n=10，（）］

表1 甘草甜素治疗后各组大鼠肝功能比较［n=10，（）］Tab.1 The comparison of liver function in different groups after Glycyrrhizin treatment ［n=10，（）］

与正常组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，#P ＜0.05。

2.3 对大鼠血脂的影响

与正常组相比，模型组大鼠血脂指标TG，TC，LDL-C和HDL-C均明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），与模型组相比，多烯磷脂酰胆碱和甘草甜素治疗后上述四个指标均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 甘草甜素治疗后各组大鼠血脂的影响［n=10，（）］Tab.2 The comparison of bloodlipid in different groups after Glycyrrhizin treatment ［n=10，（）］

表2 甘草甜素治疗后各组大鼠血脂的影响［n=10，（）］Tab.2 The comparison of bloodlipid in different groups after Glycyrrhizin treatment ［n=10，（）］

与正常组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，#P ＜0.05。

2.4 对大鼠肝脏抗氧化指标的影响

与正常组相比，模型组肝脏组织中SOD和GSH明显降低，MDA明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），与模型组相比，多烯磷脂酰胆碱和甘草甜素治疗后，SOD和GSH明显升高（P＜0.05），MDA明显降低（P＜0.05），见表3。

表3 甘草甜素治疗后各组大鼠肝脏抗氧化指标比较［n=10，（）］Tab.3 The comparison of antioxidant index in different groups after Glycyrrhizin treatment ［n=10，（）］

表3 甘草甜素治疗后各组大鼠肝脏抗氧化指标比较［n=10，（）］Tab.3 The comparison of antioxidant index in different groups after Glycyrrhizin treatment ［n=10，（）］

与正常组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，#P ＜0.05。

2.5 对大鼠肝脏中CYP2E1蛋白及mRNA表达的影响

与正常组相比，模型组肝脏组织中CYP2E1蛋白及mRNA表达明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），与模型组相比，多烯磷脂酰胆碱组和甘草甜素组上述指标均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图2、表4。

图2 大鼠肝脏组织中CYP2E1蛋白表达特点Fig.2 TheCYP2E1proteinsexpression of liver after Glycyrrhizin treatment

表4 甘草甜素治疗后各组大鼠肝脏组织中CYP2E1蛋白及mRNA表达的影响［n=10，（）］Tab.4 The CYP2E1 proteins and mRNA of liver in different groups after Glycyrrhizin treatment［n=10，（）］

表4 甘草甜素治疗后各组大鼠肝脏组织中CYP2E1蛋白及mRNA表达的影响［n=10，（）］Tab.4 The CYP2E1 proteins and mRNA of liver in different groups after Glycyrrhizin treatment［n=10，（）］

与正常组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，#P ＜0.05。

3 讨论

NAFLD发病机制较为复杂，目前国内外广泛接受的为“二次打击学说”，“二次打击学说”涉及内容较多，主要有胰岛素抵抗、氧化应激、炎症刺激、脂质过氧化、脂代谢酶分泌异常等[7]。为获得和“二次打击学说”特征相似的动物模型，本研究采用高脂饮食构建NAFLD模型，本模型不仅造模成本相较于基因剔除或过表达的动物模型便宜，其构建的模型也与“二次打击”有一定相似性，可表现出明显氧化应激和肝脏脂肪变性[8]。从结果中可以明显看出，相较于正常组，模型组大鼠出现明显肝脏病理学改变，同时肝功能和血脂有明显异常，这提示本研究所构建的模型是成功的。

模型构建成功后笔者采用甘草甜素治疗，甘草甜素是目前临床中常用的护肝药物[9]。其是中药甘草的主要活性成分之一，早在伤寒论中就对甘草进行过详细的描述，其主要功能可归纳为养心复脉、健脾利水、扶正泄痞、利咽清热、补中温阳、协调阴阳、柔肝调脾、通达表理、缓急和胃、益气健中、泻火解毒、祛痰止咳等[10]。而甘草甜素近年来也有大量文献报道，多数研究认为甘草甜素具有明显的抗病毒、抗炎、抗变态反应以及提高免疫能力等[11-12]。本研究采用甘草甜素治疗NAFLD大鼠后，研究结果发现，甘草甜素可以明显的降低肝功能指标AST和ALT，同时降低了血脂指标TG和TC，这提示甘草甜素对NAFLD有明显的治疗作用。

在NAFLD的发生和发展过程中，CYP2E1作为氧化应激的关键核心酶蛋白类，其主要负责氧化脂肪酸以及一些有害环境污染物等多种小分子底物作[13]。已有的研究已经证明CYP2E1与NAFLD密切相关，在多数NAFLD患者中，CYP2E1均呈明显过表达特点[14]，其参与氧化应激主要是通过2个方面实现的：一方面，CYP2E1可直接参与氧化应激，NAFLD发SOD和GSH等多种抗氧化的活性，同时导致机体产生较多的MDA，最终造成脂质过氧化以及炎症的发生[15]；另一方面CYP2E1是细胞脂质ω 氧化的关键核心抑制酶蛋白，CYP2E1过表达可直接造成脂质ω 氧化受阻，最终引起脂质在肝脏中蓄积[16]。本研究结果发现，与模型组相比，经甘草甜素治疗后，大鼠肝脏CYP2E1蛋白和mRNA表达均明显降低，这提示甘草甜素对肝脏CYP2E1表达有直接调控作用，同时研究结果也发现，相较于模型组，甘草甜素治疗后，肝脏组织中SOD和GSH明显升高，MDA明显降低，这提示甘草甜素对调节抗氧化能力也有一定的作用，结合CYP2E1表达，本研究认为甘草甜素对NAFLD氧化能力的提高可能是通过降低肝脏中CYP2E1的表达实现的。

综上所述，本次研究结果提示，甘草甜素对NAFLD大鼠肝功能和脂质代谢具有明显的调节作用，其作用机理可能与甘草甜素可以降低CYP2E1表达，进而提高机体的抗氧化能力有关。