ISSR分子标记技术在作物遗传育种中的应用

2020-12-17牛姣姣

广东蚕业 2020年4期

牛姣姣

牛姣姣

（新乡学院河南新乡453003）

作物遗传育种是专门研究农作物遗传改良的理论、方法与技术的科学；搞好作物遗传育种，可以为农业生产培育优良的作物品种。而ISSR分子标记技术则是一项重要的分子标记技术，该技术具有较高的稳定性与多态性，成本低廉，可以广泛应用于不同生物基因组多态性分析中。文章结合实例，阐述了ISSR技术在作物遗传育种中的应用。

ISSR分子标记技术；作物；遗传育种；应用

农作物同其他任何生物一样，在繁殖后代的过程中，其子代与亲代之间，可以保持着相似的性状。但在农作物长期世代相传的繁衍过程中，其性状也可能发生明显的变异[1]。——作物遗传育种，正是通过研究农作物遗传、变异的规律，根据国民经济与农业生产发展的需要，有意识地培育新的农作物品种。搞好作物遗传育种，可以为农业生产培育优良的作物品种，从而促进我国农业长期可持续发展。

搞好作物遗传育种，首先需要研究并掌握农作物遗传、变化的规律。研究农作物遗传、变化规律，又需要运用分子标记技术。而ISSR分子标记技术，则是具有极高实用价值的分子标记技术。

1 ISSR分子标记技术

生物子代个体间的遗传物质内核苷酸序列一旦发生变异，便会留下明显的遗传标记（生物子代个体基因组中具有明显差异性的某个DNA片段），这种标记称为DNA分子标记[2]。分子标记均匀分布于生物子代个体的整个基因组内，一旦摸清分子标记，便可掌握生物遗传变异的基本规律。因此，主要发达国家的分子生物学专家们自20世纪70年代以来一直在积极研究分子标记技术，并陆续研发出十多种分子标记技术。

1994年，加拿大蒙特利尔大学研发出ISSR分子标记技术（InterSimpleSequenceRepeat）。ISSR技术的基本原理是：在真核生物基因组中，每隔一定区段便有一个简单序列重复的SSR序列（也称微卫星DNA）。SSR序列由1～6个核苷酸为重复单位组成，具有多态性位点多、信息含量丰富、分布广泛等特点。因此，可以设计出与SSR序列相结合的PCR引物（一对可以扩增SSR序列的合适的核苷酸片段），然后，在PCR引物的3'端或5'端接上2～4个嘧啶碱基或嘌呤，对2个相距较近，方向相反的重复序列之间的DNA片段进行扩增。——如果基因组在这些扩增区域内发生DNA片段插入、缺失或碱基突变以及其他结构变异，就可能导致这些区域与引物结合的数量和位置发生改变，从而使PCR扩增片段数量及长度发生改变。通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，就可检测出基因组在这些SSR座位的多态性[3]。

由于ISSR属于显性标记，因此，ISSR技术具有较高的稳定性与多态性，可以为研究对象快速构建基因组指纹图，可以同时检测基因组多个SSR座位，可以揭示出不同生物基因组中各种简单重复序列的组成、变化频率；采用ISSR技术，DNA用量少，成本较低，技术要求低，因此，ISSR技术在作物遗传育种中可以大显身手。

2 在作物遗传育种中应用ISSR分子标记技术

在过去，人们只能凭经验进行作物遗传育种；不仅需要耗费大量时间，而且育种的成功概率也非常低。在作物遗传育种中应用ISSR分子标记技术，可以迅速查清作物的基因组序列，为作物构建基因组图谱，调查作物之间的遗传相似系数，从而提高作物遗传育种的成功率[4]。下面，我们将结合某农业大学马铃薯杂交育种试验的实例，阐述如何在作物遗传育种中应用ISSR分子标记技术。

2017年，北方某农业大学的专家们选择内蒙古一家试验农场进行了一次马铃薯杂交育种试验。选用的马铃薯母本为“JO7-2”“J07-4”“JO7-6”（均为日本马铃薯品种），选用的马铃薯父本为“陇薯6号”“陇薯7号”。专家们将“陇薯7号”与“JO7-2”进行人工杂交，获得杂交马铃薯种子A；将“陇薯6号”与“J07 -4”进行人工杂交，获得杂交马铃薯种子B；将“陇薯6号”与“JO7-6” 进行人工杂交，获得杂交马铃薯种子C；将“陇薯7号”与“JO7-6”进行人工杂交，获得杂交马铃薯种子D。

专家通过剪取马铃薯的嫩叶，提取了该次杂交育种试验5个父本、母本马铃薯的基因组DNA，然后选择5种ISSR引物，采用电泳检测，对这5种马铃薯进行了ISSR分子鉴定。

5种ISSR引物分别为：

（1）AF 18550，序列为5’-CTCTCTCTCTCTCTCTAC-3’。

（2）AW20617，序列为5’-AGCAGCAGCAGCAY-3’。

（3）AW75511，序列为5’-ACACACACACACACACY G-3’。

（4）AW20607，序列为5’-AGAGAGAGAGAGAGAGY T-3’。

（5）AF18549，序列为5’-AGAGAGAGAGAGAGAGC T-3’。

而后，专家又提取了4个杂交马铃薯种子的基因组DNA，对它们也进行了ISSR分子鉴定。结果发现：

杂交马铃薯种子A的基因组DNA中，扩增出2条父本特征带，5条父母本共有带，2条新增条带（新增带条与父本特征带、母本特征带相比存在明显差异）。

杂交马铃薯种子B的基因组DNA中，扩增出2条父母本共有带，1条父本特征带，1条母本特征带。

杂交马铃薯种子C的基因组DNA中，扩增出2条父母本共有带，5条父本特征带。

杂交马铃薯种子D的基因组DNA中，扩增出3条父母本共有带、2条父本特征带、1条新增条带（新增带条与父母本带相比存在明显差异）。

马铃薯属于自花授粉植物，通过人工授粉进行杂交育种，很容易产生伪杂种。因此，必须采用形态学或细胞学方法鉴定杂种的真实性。但形态学标志鉴定方法（主要研究植物体的质量性状与外部形态特征）、细胞学标志鉴定方法（主要研究植物体内染色体核型与染色体带型）需要耗费大量的时间，而且反映的遗传信息量也比较少[5]。采用ISSR分子标记技术，则克服了形态学鉴定方法与细胞学鉴定方法的缺陷。

在此次马铃薯杂种鉴定中，专家们进行了ISSR分子鉴定，快速提取了马铃薯杂交种子的大量遗传信息，在短时间内证实了杂种的真实性[6]。

其后，专家将杂交马铃薯种子A、B、C、D进行了栽培实验，从播种至马铃薯块茎成熟，前后历时100多天。实验结束后，专家们又仔细测量了马铃薯主茎第一花序分支处至地表的高度（株高），芽眼深度（芽眼深度低于1 mm为“浅”，芽眼深度在1～2 mm之间为“较浅”，芽眼深度在2～3 mm之间为“较深”，芽眼深度超过3 mm为“深”），计算了每一根单株结出的马铃薯块茎数量，最后还分析、测量了马铃薯内的干物质含量、淀粉含量、还原糖含量与维生素含量。结果如下。

杂交马铃薯种子A：生育期为128 d，株高在83.4～95.8 cm之间，芽眼深度较浅，单株产量在0.45 ～1.23 kg之间，单株结薯数在7～11 个之间，干物质含量在18.91 %～23.85 %之间，淀粉含量在14.30 %～18.22 %之间，还原糖含量在0.028 %～0.053 %之间，维生素C含量在16.65 ～36.44 mg/100 g之间。

杂交马铃薯种子B：生育期为128 d，株高在56.5～82.5 cm之间，芽眼深度较深，单株产量在0.33～0.81 kg之间，单株结薯数在4～7个之间，干物质含量在17.22 %～21.44 %之间，淀粉含量在13.01 %～16.94 %之间，还原糖含量在0.031 %～0.084 %之间，维生素C含量在14.70 ～15.22 mg/100 g之间。

杂交马铃薯种子C：生育期为135 d，株高在73.3～104.7 cm之间，芽眼深度较深，单株产量在0.54 ～0.99 kg之间，单株结薯数在6～12个之间，干物质含量在16.20 %～19.88 %之间，淀粉含量在11.43 %～14.71 %之间，还原糖含量在0.055 %～0.127 %之间，维生素C含量在7.83 ～15.44 mg/100 g之间。

杂交马铃薯种子D：生育期为128 d，株高在86.1～107.7 cm之间，芽眼深度较深，单株产量在0.66 ～1.17 kg之间，单株结薯数在4～14个之间，干物质含量在21.75 %～25.33 %之间，淀粉含量在17.18 %～18.21 %之间，还原糖含量在0.077 %～0.121 %之间，维生素C含量在7.85 ～27.45 mg/100 g之间。

此次栽培实验取得了圆满的成功，这充分说明在马铃薯育种中ISSR分子标记技术可以发挥很大的作用。