刘洁，高风英，卢迈新，陈刚，曹建萌， 刘志刚，王淼，韩雪晴、3

(1.中国水产科学研究院珠江水产研究所 农业农村部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室， 广东 广州 510380； 2.广东海洋大学 水产学院，广东 湛江 524025； 3.上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306)

Toll样受体家族(Toll-like receptors,TLRs)通过识别病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern)，经由下游信号转导激活免疫细胞，在先天性免疫防御病原体中起着重要作用[1-2]。在TLR信号通路中，包含TIR结构域的接头蛋白(TIR domain-containing adaptor protein,TIRAP)是第二个被描述的TLR接头蛋白[3]。有研究表明，在TLR2和TLR4信号通路中，小鼠和人的TIRAP蛋白是髓样分化因子88(myeloid differentiation factor88,MyD88)依赖途径的接头蛋白[4-5]，通过其TIR结构域与TLRs的TIR结构域相互作用，形成异源二聚体，调节下游的信号转导通路[4,6]。TIRAP蛋白含有235个氨基酸，包含一个N-末端磷脂酰基醇4,5二磷酸盐(phoshatidylinositol 4,5-二磷酸盐，PIP2)结合区域和一个C-末端TIR结构区域，其结构与MyD88不同之处在于缺乏N-末端死亡结构域[3-4]。目前，对TLRs及其信号转导通路的研究不断深入，但国内外对于TIRAP基因的研究多集中在人[5,7]、牛、鸡[8]和小鼠[4]，鱼类中仅在草鱼Cyprinuscarpio[9]、鲤Ctenopharyngodonidellus[10]、 鮸鱼Miichthysmiiuy[11]和斑马鱼Daniorerio[12]中有相关报道。

罗非鱼Oreochromisniloticus是中国淡水养殖的优势品种，养殖产量、产值和出口额均居世界第一位。但病害问题常对罗非鱼养殖业造成重大经济损失，特别是近年来链球菌Streptococcusagalactiae病的暴发，引起较高死亡率，已严重威胁到罗非鱼养殖产业的健康发展[13-15]。免疫防治是当前鱼类病害最理想的控制手段，对鱼类免疫相关的基础研究至关重要[16]，因此，研究罗非鱼免疫相关基因，了解罗非鱼免疫应答过程中的机理十分必要。目前，研究人员对尼罗罗非鱼TLR家族的部分成员已进行相关基因免疫研究[17]。本研究中，首次克隆尼罗罗非鱼TIRAP基因的cDNA 全长，分析其在各组织中的表达和病原菌感染和刺激后的诱导表达，旨在为进一步研究TIRAP基因在天然免疫系统中的作用及机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用健康尼罗罗非鱼取自中国水产科学研究院珠江水产研究所高要水产种质中心，暂养期间养殖水温为(30±2)℃，试验鱼体长为10～15 cm，体质量为20～40 g。无乳链球菌由农业农村部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室采集、分离、鉴定并保存，保存于-80 ℃超低温冰箱中[14]。

试剂：通用型RNA小量提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒均购自美基公司(广州)；pMD19-T载体、大肠杆菌EscherichiacoliDH5α感受态细胞、逆转录试剂盒Prime Script Ⅱ1st strand cDNA Synthesis Kit均购自宝生物(大连)工程有限公司；Power SYBR Green Master Mix购自Applied Biosystems公司(美国)；LPS和PolyI:C购自Sigma公司(美国)。引物合成及测序由广州生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 尼罗罗非鱼TIRAP基因全长cDNA的克隆

使用RNA小量提取试剂盒从尼罗罗非鱼鳃组织提取总RNA，并用10 g/L琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其浓度和质量。使用逆转录试剂盒合成第一链cDNA。根据GenBank中尼罗罗非TIRAP基因推测序列(GenBank XM_005474605.4)，利用Premier 5.0分两段设计引物TIRAP-sf1-sr1和TIRAP-sf2-sr2进行扩增(表1)，预计产物长度分别为1 755 bp、2 340 bp。PCR反应体系(共50 μL)包括：cDNA模板1.0 μL，20 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，10×LA PCR buffer(含Mg2+)5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 4.0 μL，5 U/μL LA Taq DNA 聚合酶0.5 μL，ddH2O 37.5 μL。PCR反应程序为：94 ℃下预变性3 min；94 ℃下循环变性30 s，退火复性30 s(TIRAPcDNA中间片段和下游片段退火温度分别为63、55 ℃)，72 ℃下延伸 2 min，共进行35个循环；最后在72 ℃下再延伸 10 min，4 ℃下保存。将PCR得到的目的条带切胶回收，克隆到pMD19-T载体上，随后转化到大肠杆菌DH5α中，利用氨苄抗性平板筛选阳性克隆并进行菌液PCR检测，筛选阳性克隆进行测序。

利用DNAStar软件中SeqMan对获得的两段序列进行拼接，获得其cDNA序列。根据所获得的cDNA序列，利用Premier 5.0设计一对引物TIRAP-ORF1和TIRAP-ORF2(表1)进行PCR扩增以验证拼接的准确性，片段长度为1 036 bp。模板、反应体系及条件、胶回收、克隆和测序方法同上。

1.2.2TIRAP基因生物信息学分析 使用NCBI网站的Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi)程序进行序列同源性分析；使用Vector NTI 8.0等软件分析该基因的cDNA序列，确定开放阅读框并推导其氨基酸序列。运用ExPASy ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)在线工具分析该氨基酸序列的理化性质，用ExPASy ProtScale(https://web.expasy.org / cgi-bin /protscale/protscale.pl)预测其疏水性。使用TMpred(embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)预测跨膜区。利用SOPMA在线网站(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测蛋白的二级空间结构，利用Phyre2在线网站(http://www.sbg.bio.ic. ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)预测蛋白的三级空间结构，以在线软件SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测蛋白质结构。利用软件Vector NTI 8.0和Clustal Omega Program(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)对尼罗罗非鱼及其他物种TIRAP的氨基酸序列进行多重序列比对，使用 MEGA 7 软件中的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统进化树。

1.2.3 人工感染无乳链球菌 取暂养的健康尼罗罗非鱼60尾，平均分成1个对照组和3个试验组。将无乳链球菌于37 ℃下培养16 h，浓度约为3×109CFU/mL(colonyforming units)，使用磷酸缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)将其稀释为3×106、3×107、3×108CFU/mL 3个浓度，试验组腹腔注射200 μL稀释菌液，对照组注射等量PBS溶液，获得半致死浓度为3×107CFU/mL。

取个体大小相近的160尾尼罗罗非鱼，平均分为两组，试验组腹腔注射200 μL(3×107CFU/mL)无乳链球菌，对照组注射等体积PBS溶液。注射后0 h、8 h及1、2、3、6、9 d时，取肠、鳃、脾、肾和血5个组织，每个时间点取4尾鱼，用液氮速冻后转入-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.2.4 LPS和PolyI:C刺激试验 取个体大小相近的150尾健康尼罗罗非鱼个体，平均分成1个对照组和2个试验组。将LPS和PolyI:C用PBS配制成质量浓度为1 mg/mL的溶液，2个试验组分别腹腔注射配制好的LPS和PolyI:C溶液100 μL，对照组注射等体积的PBS溶液。注射后0、8 h及1、2、3、4、5 d时，从2个试验组分别取肠、肝、脾和肾4个组织，每个时间点取4尾鱼，用液氮速冻后转入-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.2.5 健康罗非鱼基因组织表达样品采集 随机选择暂养的6尾健康尼罗罗非鱼个体，取其肝、皮肤、心脏、肾、胃、鳃、脑、脾、肠、血液和肌肉11个组织，用液氮速冻后转入-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.2.6 实时荧光定量PCR检测尼罗罗非鱼TIRAP基因组织表达 取出-80 ℃超低温冰箱中保存的人工感染无乳链球菌、LPS、PolyI:C的各组织样品，分别提取每尾鱼各组织样品RNA，并取1 μg反转录成cDNA作为RT-qPCR模板。

定量引物的设计基于TIRAP的cDNA全长序列(表1)，内参基因为翻译延伸因子基因(elongation factor-1 alpha,EF-1α)[18]，标准曲线的制作参照高风英等[19]的方法，试验在StepOnePlusTM Real-Time PCR仪上以SYBR Green Ⅰ法进行定量扩增。反应体系(共20 μL)包括：cDNA模板1 μL，20 μmol/L上、下游引物各0.3 μL，Power SYBR Green Master Mix 10 μL，去离子水 8.4 μL。PCR反应程序为：50 ℃ 下作用2 min；95 ℃下预变性2 min；95 ℃ 下循环变性15 s，55 ℃ 下退火复性30 s，72 ℃ 下延伸1 min，共进行40个循环。溶解曲线分析：95 ℃下反应15 s，60 ℃下反应1 min，95 ℃下反应15 s。每个待测cDNA样品设置3个重复，每板均设阴性对照。TIRAP基因相对表达量的计算公式为

F=(a/b)/(c/d)。

其中：a为试验组中目的基因浓度；b为试验组中内参基因浓度；c为对照组中目的基因浓度；d为对照组中内参基因浓度。

1.3 数据处理

采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，采用LSD 法进行多重比较，试验数据以平均值±标准误(means±S.E.)表示，显著性水平设为 0.05。

表1 试验所用引物Tab.1 Primers used in this study

2 结果与分析

2.1 尼罗罗非鱼TIRAP基因的cDNA序列分析

运用分段扩增技术得到尼罗罗非鱼TIRAPcDNA序列全长为3913 bp，5′端非翻译区(5′UTR)长度为137 bp，3′端非翻译区(3′UTR)长度为2 900 bp，开放阅读框序列(ORF)为876 bp，编码291个氨基酸残基(图1)。预测其蛋白相对分子质量为32 650，理论等电点(pI)为6.59。用ProtParam在线工具分析可得，TIRAP分子中带负电荷的氨基酸残基(Asp+Glu)有29个，带正电荷的氨基酸残基(Arg+Lys)有27个，脂肪族指数为74.02，预测其不稳定指数为66.06，划分为不稳定蛋白。疏水性分析显示，TIRAP氨基酸序列亲水性平均值为-0.480，属于亲水性蛋白，且在第31位达到最高疏水性，疏水指数为1.944；第457位达到最高亲水性，亲水指数为-2.844。用TMpred软件分析发现，TIRAP蛋白第26～46位氨基酸之间存在21个由膜内向膜外的跨膜氨基酸，在第27～45位氨基酸间存在19个由膜外向膜内的跨膜氨基酸。用SOPMA预测TIRAP的二级结构，结果显示，116个氨基酸残基呈现α-螺旋结构(占肽链氨基酸总数的39.86%)，31个氨基酸残基呈延伸链结构(占10.65%)，19个氨基酸残基呈β-折叠结构(占6.53%)，125个氨基酸残基呈无规则卷曲结构(占42.96%)。用Phyre2构建尼罗罗非鱼TIRAP蛋白可能的三级结构模型如图2(a)所示。运用SMART在线工具对尼罗罗非鱼TIRAP蛋白的二级结构域进行预测，结果显示，该蛋白第77～217位氨基酸处存在TIR结构域(图2(b))。

2.2 氨基酸序列比对及系统进化分析

TIRAP氨基酸序列的比对分析显示，在TIR结构域3信号框(Signaling Box)的典型结构中，参与比对的哺乳类TIRAP蛋白TIR结构域Box1、Box2、Box3基本一致，与鱼类保守区域存在差异(图3)。Blast分析显示，尼罗罗非鱼TIRAP蛋白和其他鱼类TIRAP蛋白序列具有较高的相似性，其中与快乐东方鲷AstatotilapiacallipteraTIRAP的一致性最高，为92.78%，与斑马宫丽鱼Maylandiazebra的一致性也较高，为92.44%，与斑马鱼、小鼠、人和牛的一致性较低，分别为40.55%、42.86%、39.56%和40.21%(图4)。系统进化分析结果显示，尼罗罗非鱼与快乐东方鲷、斑马宫丽鱼聚为一簇，亲缘关系较近(图4)。

2.3 尼罗罗非鱼TIRAP基因的组织表达

2.3.1 健康尼罗罗非鱼TIRAP基因的组织表达分析 尼罗罗非鱼胃、肾、肝、鳃、皮肤、肠、脑、心脏、血液、脾和肌肉中TIRAP基因均有表达，但表达量存在显著性差异(P<0.05)；以胃中的TIRAP表达量作为对照，肌肉和脾脏中的TIRAP表达量最高，分别为对照组的12.85和4.43倍；胃和肾脏中的表达量显著低于皮肤、肠、脑、心脏、血液、脾和肌肉组织(P<0.05)(图5)。

2.3.2 人工感染无乳链球菌后TIRAP基因的表达变化 从图6可见：尼罗罗非鱼肠、鳃和肾中TIRAP的表达量呈现先上调再下调的趋势，感染后1 d时其表达量均达到最大值(P<0.05)，分别为对照组的4.56、1.49和3.30倍；脾和血液中TIRAP的表达量呈现波动式变化，均在感染后1 d时表达量出现显著下调(P<0.05)，感染后2 d时表达量回升，感染后3～9 d时表达量呈下调趋势。

2.3.3 LPS刺激后TIRAP基因的表达变化 从图7可见：尼罗罗非鱼肠中TIRAP的表达量3 d后呈现下调趋势；肝脏和肾中TIRAP的表达量均在注射后8 h时达到最大值，分别为对照组的2.87和4.13倍；脾中TIRAP的表达量总体呈上调趋势，注射1 d时达到最大值，为对照组的2.51倍。

2.3.4 PolyI:C刺激后TIRAP基因的表达变化 从图8可见：肠中TIRAP的表达量呈现下调趋势，注射后8 h时达到最小值；肝脏、脾脏和肾脏中TIRAP的表达量均在注射后1 d时达到最大值，分别为对照组的5.04、1.97、2.78倍，整体呈现波动式变化趋势。

3 讨论

3.1 尼罗罗非鱼TIRAP基因的序列特征

本研究中克隆获得了尼罗罗非鱼TIRAP基因的cDNA序列，全长为2 900 bp，包含完整的ORF，可编码291个氨基酸。序列分析表明，尼罗罗非鱼TIRAP与Toll样受体一样含有TIR结构域，推测当受体胞外区和配体结合后，导致Toll样受体胞内区通过TIR-TIR结构域的相关作用而俘获TIRAP接头蛋白[20]。 研究表明，哺乳动物TIRAP可作为TLR2、TLR4与MyD88间的桥梁，参与信号传导并激活下游转录因子[4-5,7]。Liu等[12]发现，斑马鱼TIRAP的过表达未能激活人胚肾细胞293T中的NF-κB(nuclear factor-kappa B)，但可轻微激活鲤白细胞中NF-κB，这是由于斑马鱼与人类TIRAP的N末端氨基酸差异及斑马鱼Box2中保守的脯氨酸突变为亮氨酸，从而导致其功能障碍。尼罗罗非鱼Box2中脯氨酸未发生突变，推测未影响其对NF-κB激活的功能。Xu等[11]研究表明，鮸TIRAP无法激活293T细胞中的NF-κB报告基因，但可通过与MyD88相互作用在TLR1信号通路中激活NF-κB。此外，Shan等[10]发现，鲤TLR8可能募集TIRAP接头蛋白并在免疫应答中激活活化蛋白1(activator protein 1,AP-1)通路。上述研究表明，不同鱼类TIRAP参与的TLRs信号通路及其功能可能存在不同。同源性比较和系统进化分析显示，在鱼类中，尼罗罗非鱼TIRAP与快乐东方鲷及斑马宫丽鱼TIRAP相似性最高，一致性分别为92.78%和92.44%，在进化上表现出一定的保守性。

3.2 尼罗罗非鱼TIRAP基因在免疫应答中的表达分析

RT-qPCR检测表明，尼罗罗非鱼TIRAP在检测的各个组织中均有表达，表明其在多种组织中起作用。各组织表达的差异，表明TIRAP在不同器官中起作用不同。在肌肉中其表达量最高，其次为脾脏和血液，在胃和肾中的表达量较低。在肌肉中高表达可能暗示尼罗罗非鱼TIRAP基因已经获得了非特异信号转导功能[20-21]。此外，TIRAP在非免疫组织肌肉中的高表达，说明其并不仅限于在免疫系统中发挥作用，也可能具有调控肌肉生长的生物学功能，这还有待进一步研究证实。在周作勇[8]的研究中也发现类似现象，鸡TIRAP在肌肉中的表达高于肝脏、肾脏和肠道等免疫组织和器官。脾脏和血液在鱼类免疫中发挥着重要的作用，分别是鱼体中重要的免疫器官和免疫场所[22]。在斑马鱼脾脏中TIRAP也有较高的表达量[12]。免疫相关基因在脾脏和血液中存在较高的表达水平在以往的研究中也有所报道，在尼罗罗非鱼的11个组织中，脾脏和血液中TRIM16和TRIM25均有较高水平表达量[23]。以上结果提示，TIRAP基因与这些组织器官中的免疫应答过程密切相关。

TIRAP作为一类重要的衔接蛋白，在MyD88依赖型信号转导途径中具有重要作用。本研究中通过用革兰氏阳性菌(无乳链球菌)、革兰氏阴性菌(LPS)和病毒类似物(PolyI:C)作为病原体对尼罗罗非鱼进行人工感染和刺激，研究了TIRAP基因在免疫组织中mRNA水平的定量表达模式。结果表明，这3种不同的病原均可引起尼罗罗非鱼TIRAP基因的表达变化，而每种组织的基因表达模式并不相同。由于不同组织中存在的免疫细胞种类差异，如吞噬细胞中的粒细胞主要分布在脾脏中，肠道中主要有上皮内淋巴细胞和杯状细胞，因此，在受到不同病原刺激后，各组织中的免疫细胞可能处于不同的防御状态，导致TIRAP基因在不同组织中的表达模式存在差别[24]。人工感染无乳链球菌后，尼罗罗非鱼脾脏和血液中TIRAP的表达量表现出上升和下降交替，肠、鳃和肾中TIRAP的表达量呈现先上升再下降的表达谱。高风英等[19]的研究中也发现，尼罗罗非鱼人工感染无乳链球菌后，鳃、肾、心脏和脾脏中β2m基因的表达呈现先上升后下降的趋势。推测是一种免疫系统的自我保护与自我调整，当表达量升高到一定程度，机体会通过免疫负调控降低其表达量，避免因免疫调控因子过度表达引起对机体的伤害[18]。

本研究显示，受LPS刺激后，TIRAP在肝脏、脾脏和肾脏中的表达呈先上升再下降的趋势，TIRAP基因表达先上调，以诱导干扰素表达抵抗LPS入侵，之后表达下调可能是因为细菌为逃避宿主先天免疫防御的作用效果，同时LPS也下调了TIRAP在肠中的表达。丁少青[25]也发现类似现象，东北七鳃鳗Lethenteronmorii受铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa(G-)感染后，TLR2d基因在肠中的表达量呈下降趋势，在感染后12、48 h时降到最低值。有研究表明，包含肠黏膜在内的鱼类黏膜系统，可能相对于包含传统免疫器官如头肾、脾脏等的系统在免疫过程中具有一定的自主性和独立性[26]。在肠中的下调趋势说明TIRAP基因参与了尼罗罗非鱼对LPS的响应，但可能是负调控机制。

PolyI:C为双链RNA的类似物，可以刺激鱼类的非特异性免疫。PolyI:C能明显上调尼罗罗非鱼TIRAP在肝脏、脾脏和肾中的表达，这与赤眼鳟Squaliobarbuscurriculus受病毒刺激后MyD88的反应相似[27]。而在肠中的表达呈显著下调趋势，同样是接头蛋白的TRIF，青岛文昌鱼Branchiostomabelcheritsingtauense应对PolyI:C刺激后，肠中TRIF的表达呈波动式变化，在注射后72 h表达量达到最高[28]。这可能与宿主不同相关，同时，这也可能是这两个接头分子受到不同Toll样受体刺激后信号传导差异的结果。这些结果表明，无乳链球菌感染及LPS和Poly I:C刺激均能引起TIRAP基因表达变化，但时间点、反应强度有较大差异。尼罗罗非鱼TIRAP参与了细菌和病毒相关的免疫应答反应，暗示其在宿主抵御病原入侵过程中可能发挥重要作用。

4 结论

1)使用反转录PCR技术克隆获得了尼罗罗非鱼TIRAPcDNA全长为2 900 bp，发现尼罗罗非鱼TIRAP具有TIR结构域。

2)TIRAP基因在健康尼罗罗非鱼肌肉和脾脏中的表达量最高。

3)无乳链球菌、LPS和Poly I:C刺激均能诱导TIRAP基因表达，表明TIRAP在先天免疫屏障中发挥作用，参与了尼罗罗非鱼抗病免疫反应。