吴殿超，霍志斌， 赵笑枫

(河北省邢台市人民医院 胃肠肿瘤外科，河北 邢台 054031)

结肠癌属于消化系统高发病率恶性肿瘤，原发于结肠黏膜上皮的恶性肿瘤，发病特点由粘膜层向浆膜层浸润，产生淋巴及远处转移，恶化病情。结肠癌的产生原因较复杂，环境因素占据本病发生的80%，剩余与家族遗传癌变基因等相关[1]。目前，结肠癌的发生机制尚不清楚，手术及放化疗能够治疗结肠癌，但是部分患者会出现术后肿瘤细胞转移及复发，威胁患者生命健康[2]。因此，寻找新型有效的治疗方法是改善患者的重要手段。

lncRNA属于超过200 nt的长链非编码RNA，其生物功能具有广泛性，能够通过调控DNA转录在不同疾病中发挥不同作用。随着人们研究深入，lncRNA与结肠癌发生发展具有相关性。长链非编码RNA(lncRNA)母系表达基因3(Maternally expressed gene 3,MEG3)是潜在的肿瘤抑制物，定位于染色体14q32，被研究学者证实在肝癌、肺癌等恶性肿瘤中能够对肿瘤细胞进行调控，并在上述恶性肿瘤中表达缺失[3]。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)又称促血管素，最初在肿瘤细胞中被发现，能够提高血管通透性。文献表示，VEGF在不同肿瘤细胞中表达及功能也存在差异[4]，然而，目前关于MEG3对结肠癌细胞及VEGF的文献较少，因此，本文通过探讨MEG3对结肠癌细胞生物活性及VEGF水平影响，现研究内容如下。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 人结肠癌细胞系SW480购自中国上海信裕生物科技。

1.2 主要试剂与仪器 MEG3mimics、MEG3-NC购自中国广东Invitrogen公司合成；VEGF和GAPDH抗体购自USA Abeam公司；MTT、DMSO均购自中国上海慧颖生物；8517型超低温冰箱购自USA FORMA公司；MLB倒置荧光显微镜购自日本尼康公司；GAPDH购自上海北诺生物科技有限公司。

1.3 SW480细胞培养 将低温冷藏的人结肠癌细胞系SW480，快速移入37 ℃水中溶解，离心后，离弃上清液，加入RPMI培养基，37 ℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养，贴壁生长，次日更换新的培养液，生长到90%时，加入蛋白液消化，1～3传代37 ℃保存，以备后用。

1.4 细胞分组及处理方法 将SW480细胞分为对照组(SW480细胞)、NC组(SW480细胞转染MEG3-NC)和MEG3组(SW480细胞转染MEG3mimics)，细胞全部融合后，放入200 μL转染液体和4 μL脂质体，按照Lipofectamine 2000说明书进行，分别加入MEG3-NC、MEG3mimics后，培养36 h，次日更换培养液，转染8h后PCR检测转染是否成功。

1.5 QRT-PCR检测MEG3表达 将3组SW480细胞加入胰蛋白酶消化，进行PBS冲洗，并加入1.5mL lncRNA MEG3载体试剂提取RNA，取细胞悬液30 mg放于EP管中，利用 Trizol 提取细胞总mRNA，反转录cDNA,内参基因是GAPDH，进行RT-PCR扩增，反应条件：98 ℃ 6 min，98 ℃ 28 s，75 ℃ 30 s,80 ℃ 4 min，总计55个循环。引物序列见表1。

1.6 MTT法检测SW480活性 转染后各组SW480细胞，接种于96板中，分别转染24、48、72 h后，加入100 mL的MTT液，培养4 h后，加入150 μL DMSO振荡，采用酶标仪检测490 nm波长处的吸光值(A)，观察SW480细胞增殖情况，描绘生长曲线，细胞生长抑制率=[1-(实验组/对照组)]×100%。

1.7 Transwell小室法检测SW480细胞侵袭能力 将50 mg/L的基质胶稀释后加入小室上层，37 ℃下呈凝胶状态，细胞数目为1×105/mL，上室中加入细胞悬液，下室中加入少量胎牛血清培养基，37 ℃，培养48 h，取出培养基，拭去残留细胞，0.1%结晶紫染色，于倒置显微镜下拍照、计数。随机选择4个视野，计算SW480侵袭细胞数。

1.8 Hoechst染色检测细胞凋亡 转染后的对数生长期细胞数目为1×105/mL SW480细胞，采用40 g/L的多聚甲醛固定0.5 h，采用TrintonX-100透明处理，加入Hoechst荧光染色，常温下0.5 h后，细胞凋亡：SW480细胞核固缩，呈现碎片状，凋亡率=凋亡细胞/细胞总数×100%。

1.9 免疫印迹检测VEGF蛋白水平 转染后的对数生长期细胞数目为1×105/mL SW480细胞重悬细胞，冰上裂解60 min后，进行13 000 rpm离心10 min，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度。采用40 μg的上样量进行10%电泳，PVDF膜TBS浸泡10 min，反复PBS冲洗，5 min/次，分别加入VEGF、GAPDH(1∶1 000)，加入羊抗兔(1∶1 000)、过氧化物酶标记二抗(1∶2 000)，分别杂交，PBS冲洗。后将膜浸入ECL工作液，随后进行检测，获取图象。

1.10 免疫组化检测VEGF阳性表达 转染后各组SW480细胞进行爬片处理，入2%甲醛，固定，75%、85%及95%梯度酒精脱水，观察胶原沉积，苏木精染色观察VEGF阳性表达。阳性表达：以浅棕色至黄棕色为阳性标准。

2 结果

2.1 PCR检测3组SW480细胞lncRNA MEG3相对表达 对照组和NC组SW480细胞lncRNA MEG3相对表达量分别为1.00±0.00和1.05±0.04比较无意义(P>0.05)，MEG3组表达升高与其余组别存在意义(P<0.05，见图1)。

*：与对照组相比， P<0.05；#：与NC组相比， P<0.05。图1 3组SW480细胞lncRNA MEG3相对表达

2.2 MTT检测 MEG3对3组SW480细胞抑制率比较 不同时间点，对照组及NC组SW480抑制率水平相似(P>0.05)，与MEG3组比较，对照组及NC组SW480抑制率均降低(P<0.05)，相同时间点，MEG3组SW480抑制率均对照组及NC组(P<0.05)，对照组及NC组SW480抑制率水平相似(P>0.05，见表1)。

2.3 Transwell小室法检测MEG3对3组SW480细胞侵袭数目比较 对照组，NC组及MEG3组SW480细胞侵袭数目分别为(48.90±7.71)个，(44.12±6.90)个及(22.30±3.26)个，对照组、NC组细胞侵袭数目相似(P>0.05)，MEG3组细胞侵袭数目低于其他两组(P<0.001)，见图2。

表2 MEG3对3组SW480细胞抑制率比较

A:对照组；B：NC组；C：MEG3组；*：与对照组相比， P<0.05；#：与NC组相比， P<0.05。图2 MEG3对3组SW480细胞侵袭数目比较

2.4 Hoechst染色检测MEG3对3组SW480细胞凋亡率比较 对照组、NC组及MEG3组SW480细胞凋亡率分别为(7.46±0.72)%，(8.12±1.03)%及(31.13±3.22)%，对照组、NC组细胞凋亡率相似(P>0.05)；与对照组、NC组比较，MEG3组细胞凋亡率升高(P<0.05，见图3)。

A:对照组；B：NC组；C：MEG3组；*：与对照组相比， P<0.05；#：与NC组相比， P<0.05。图3 MEG3对3组SW480细胞凋亡率比较

2.5 免疫印迹检测3组SW480细胞中VEGF蛋白相对表达 对照组、NC组及MEG3组SW480中VEGF蛋白相对表达水平分别为1.00±0.00，0.91±0.04及0.48±0.05，对照组、NC组VEGF蛋白表达相似(P>0.05)；与对照组、NC组比较，MEG3组VEGF蛋白相对表达水平降低(P<0.05，见图4)。

A:对照组；B：NC组；C：MEG3组；*：与对照组相比， P<0.05；#：与NC组相比， P<0.05。图4 3组SW480细胞中VEGF蛋白表达

2.6 免疫组化检测3组SW480细胞中VEGF阳性表达 棕黄色为阳性细胞，对照组、NC组及MEG3组SW480中VEGF阳性表达不同，对照组、NC组SW480中VEGF阳性表达分别为(9.60±1.22)%和(10.30±1.30)%相似(P>0.05)， MEG3组(2.30±0.40)%中VEGF阳性表达低于对照组、NC组(P<0.05，见图5)。

A:对照组；B：NC组；C：MEG3组。图5 3组SW480细胞中VEGF阳性表达

3 讨论

结肠癌的产生是多因素发展共同结果，与患者肥胖、饮食习惯及低体力劳动相关。结肠癌患者初期可表现为排便习惯改变，后期变现为血便及腹部肿胀疼痛，并伴随不明原因的消瘦等，早期患者5年生存率达到80%左右[5]。长链非编码RNA是由多个核苷酸组成的具有调节DNA表达的非编码RNA。近些年，研究表示，它参与了细胞生长、失活、淋巴浸润等，DNA影响癌细胞生物活性[6]。MEG3属于其中之一，已经被证实在抑制食管癌细胞及肝癌细胞发挥重要作用，但是，在结肠癌中作用还需进一步研究。文献表明，VEGF及其受体异常表达能够提高恶性肿瘤生物活性[7]。本文通过对结肠癌细胞转染MEG3观察其生物活性及VEGF水平研究分析。

MEG3在机体脑组织内表达水平最高，在机体其他组织细胞内表达较低。研究表示，在在结肠癌组织及细胞内MEG3几乎无表达，这与以往研究文献相似[8]。MEG3作为天然分子结构体能够通过基因调控细胞活性，在结肠癌细胞中敲减MEG3能够加快癌细胞增殖，表示MEG3能够作为抑癌因子发挥作用[9]。赵月鸣等[10-11]研究表示，MEG3过表达抑制了结肠癌细胞Bcl-2的表达，提高了Bax的表达，说明MEG3可启动肿瘤细胞凋亡机制。MEG3提高Caspase-9水平，MEG3可以通过激活内源性凋亡途径诱导细胞凋亡[13]。结肠癌细胞凋亡主要通过线粒体、内质网调控，其中Caspase12为内质网应激因子，MEG3能够启动内质网应激加快结肠癌细胞凋亡，抑制其活性[14]。本文研究表示在肠癌细胞中转染MEG3能够抑制结肠癌细胞生长，减少恶性侵袭，加快凋亡。研究机制转染长链非编码RNA MEG3能够通过抑制血管内皮细胞活性，降低VEGF水平，加快结肠癌凋亡。

众多文献证实，VEGF过表达能够诱导肿瘤生长，增加血管生成。目前，研究中有多个血管因子被证实，VEGF过表达能够提高结肠恶性肿瘤生长营养成分，加快肿瘤体积生长[15-16]。VEGF对肿瘤细胞的转移及生长起着关键作用，VEGF可促进肿瘤血管再生，其肿瘤细胞机体大小均受到VEGF水平的干预。VEGF是重要的促血管生长因子，能够调节血管内皮细胞的迁移和增殖，能够改变血管密度及血管的通透性，引导血管内皮细胞迁移，稳定新生血管，是肿瘤生长的重要条件[17]。在体外实验研究表示，在脑梗死大鼠脑组织中发现VEGF水平及其受体显著升高，检测MEG3呈现低表达状态，表示MEG3失活是导致血管生成的主要原因[18]。MEG3为长链非编码RNA，能够抑制肿瘤生存，减少癌细胞发生浸润和转移。结肠癌细胞中MEG3的过表达能够诱导细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，MEG3通过和VEGF通路的相互作用，对肿瘤新生血管的生成发挥调节作用，影响肿瘤的发生发展以及肿瘤的转移和浸润。在结肠癌细胞中激活MEG3水平能够加快p53活性进行负向调节VEGF转录。但是其研究机制还需要进一步研究。本文研究表示，MEG3组结肠癌细胞中VEGF蛋白水平、阳性表达均低于对照组和NC组，说明在结肠癌细胞中转染MEG3能够降低VEGF表达，减少肿瘤再生，这与朱栋良等[20]研究结果相似。

综上所述，在结肠癌细胞中转染MEG3能够抑制其活性，加快凋亡，其研究机制可能与MEG3能够抑制VEGF表达相关，VEGF表达降低可改变血管的通透性，减少肿瘤血管新生，从而降低结肠癌细胞活性。