两个褐飞虱海藻糖转运蛋白基因的结构及调控海藻糖代谢功能

2020-12-10於卫东潘碧莹邱玲玉黄镇周泰叶林唐斌王世贵

中国农业科学 2020年23期

於卫东，潘碧莹，邱玲玉，黄镇，周泰，叶林，唐斌，王世贵

於卫东1,2，潘碧莹1，邱玲玉1，黄镇2，周泰2，叶林2，唐斌1，王世贵1

（1杭州师范大学生命与环境科学学院，杭州 310036；2浙江鼎益生物科技有限公司，浙江衢州 324100）

【】海藻糖是昆虫中的主要血糖物质，在昆虫的发育及生理活动中发挥重要功能。其中，海藻糖转运蛋白（Tret）在将海藻糖从其生成组织（例如脂肪体）运输到其消耗组织的过程中起着重要作用。本研究通过分析褐飞虱（）两条Tret1的序列结构，进一步抑制的表达，探讨这两个NlTret1在褐飞虱体内的生物学功能。【】以褐飞虱两条Tret1序列为研究对象，利用生物信息学技术分析其蛋白结构以及与其他昆虫之间的同源性。采用RNAi（RNA interference）技术将合成的外源dsRNA（double-stranded RNA）注射到实验室饲养褐飞虱种群体内，抑制其体内的表达，分别在注射48 h后取材，抽取总RNA并用反转录试剂盒合成第一链cDNA，采用qRT-PCR（quantitative real-time PCR）技术检测ds的干扰效果以及RNAi后褐飞虱体内海藻糖代谢通路中相关基因的表达，最后测定葡萄糖、海藻糖和糖原含量以及海藻糖酶活性。【】生物信息学分析表明，和的开放阅读框长度分别为1920和1578 bp，分别编码639和525个氨基酸，预测蛋白分子量分别为69.29和58.71 kD，等电点分别为8.32和8.36；NlTret1-like X1和NlTret1-2 X1的二级结构主要包含螺旋和卷曲；保守结构域分析显示它们均属于MFS家族。进化分析结果显示，不同昆虫的Tret1蛋白具有较高的同源性，且褐飞虱与其他半翅目昆虫具有较近的亲缘关系；与注射ds组相比，注射靶标基因的dsRNA后均能够显著沉默本基因的表达；褐飞虱体内糖原、葡萄糖在注射ds和ds后，其含量均无显著变化，然而不同于注射ds组，在注射ds后褐飞虱体内海藻糖含量极显著升高；干扰48 h后褐飞虱体内、、、和的表达均极显著下调；而干扰48 h后褐飞虱体内、和的表达虽也极显著下降，但和极显著上调；在注射ds后，试虫可溶性海藻糖酶和膜结合型海藻糖酶的活性均极显著降低，而在注射ds后无显著变化。褐飞虱的两个Tret1在不同组织间发挥着不同的功能，其中NlTret1-like X1在特异性转运海藻糖参与能量供应中起到更为显著的作用。研究结果有助于探索Tret1在昆虫或无脊椎动物中调控海藻糖代谢平衡的调节机制，可为将来通过调控血糖平衡来控制褐飞虱等害虫提供理论依据。

褐飞虱；海藻糖转运蛋白；结构；海藻糖代谢；RNA干扰

0 引言

【研究意义】我国水稻（）年种植面积为3 000万公顷，总产量约达2亿吨以上[1]。作为一种被广泛种植和食用的粮食作物，水稻生产的质量与产量关系着国家粮食安全。然而其生产和储存过程中常常受到各种害虫的威胁，其中褐飞虱（）是对水稻生产危害最为严重的害虫[2-4]。20世纪70年代后，水稻种植密度提高、土壤肥力增加及品种交替频繁等因素使褐飞虱的威胁日益加剧[5]。目前，生产中主要依靠化学杀虫剂来防治褐飞虱，但化学杀虫剂的过度使用对环境和天敌均造成一定影响，并诱发抗药性[6-10]。因此，环保且高效的新型绿色防控方法的开发迫在眉睫。【前人研究进展】海藻糖被称为“昆虫的血糖”，在昆虫的生长发育和抗逆等方面具有重要作用[11-15]。昆虫体内海藻糖合成途径主要为TPS-TPP途径，海藻糖的合成依赖于海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）的催化作用，而海藻糖分解代谢需要海藻糖酶（trehalase，TRE）的帮助，其中海藻糖酶又可分为两种，可溶型（TRE1）和膜结合型（TRE2）[16]。目前对昆虫海藻糖代谢的研究主要集中于海藻糖的合成或分解途径[15,17]，对于昆虫血糖-海藻糖转运过程的研究却非常少。众所周知不管是海藻糖还是葡萄糖，它们都不能像水或者脂肪一样直接穿过细胞膜，而需要在特殊的物质——糖转运蛋白（sugar transporter，ST）的帮助下才能顺利地进出细胞，并发挥具体的功能。糖转运蛋白属于MFS（major facilitator superfamily）超家族，是动物中最丰富的小分子转运体[18]，葡萄糖转运蛋白和海藻糖转运蛋白是其中的两种。在医学研究中，葡萄糖转运蛋白被报道与I型糖尿病有关，也被视为癌症的治疗靶点[19]。在植物中，糖转运蛋白也被证实与果实的成熟等有关[20]。在昆虫中，海藻糖转运蛋白1（trehalose transporter1，Tret1）被发现可响应细胞内和细胞外梯度转运海藻糖[21]。此外，有研究表明褐飞虱不能直接利用所吸食的水稻中的蔗糖，但糖转运蛋白可以介导蔗糖进入飞虱体内[22-23]。目前，在褐飞虱中已经鉴定出18个推定的糖转运蛋白，其中7个在肠道中高度表达[24]。进一步的研究显示，NlST1和NlST16是葡萄糖转运蛋白而NIST6是果糖转运蛋白[25]。【本研究切入点】褐飞虱其他糖转运蛋白尤其是海藻糖转运蛋白的功能并未有更深入的研究。此外，褐飞虱虽然是一种农业害虫，但是也非常适合作为基因功能研究的靶标昆虫[26-27]。【拟解决的关键问题】通过对两个NlTret1的结构以及在调控海藻糖代谢中的潜在功能进行探究，评估NlTret1作为新型杀虫剂靶点的可能性，为开发绿色农药提供理论依据。

1 材料与方法

试验于2018年7月至2019年7月在杭州师范大学完成。

1.1 NlTret1及蛋白序列分析

首先通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站搜索获得两条基因序列，然后通过NCBI网站上的BLAST-N和BLAST-X工具，将的cDNA序列与GenBank中存在的其他海藻糖转运蛋白的基因序列进行比较。使用多序列比对网站（http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html）上提供的工具和DNAMAN软件对昆虫海藻糖转运蛋白氨基酸序列进行多序列比对。使用ExPASy蛋白质组预测工具网站（http://expasy.org/tools/dna.html）上的翻译工具，从相应的cDNA序列推导出本研究中使用的NlTret1蛋白序列和其他分析标准，包括相对分子质量（molecular weight，MW）、等电点（isoelectric point，pI）等。通过使用SMART（http://smart.embl-heidelberg. de）和TMHMM Server 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/）分别预测NlTret1功能域和跨膜域。选取已知NlTret1蛋白的氨基酸序列，使用MEGA 5.2软件，采用邻接法构建系统发育树，同时进行自举分析，并使用1 000次重复验证每个群集的稳健性。

1.2 供试昆虫

供试褐飞虱为杭州师范大学动物适应与进化重点实验室饲养种群，其初始虫源来自中国水稻研究所杭州种群。饲养用水稻均为感虫品系TN1（Taichung Native 1）。褐飞虱饲养条件：温度（25±1）℃，光周期16L﹕8D，相对湿度（70±5）%。待TN1水稻上的褐飞虱若虫长至5龄后，用于后期RNAi显微注射试验。

1.3 褐飞虱总RNA的抽提及第一链cDNA的合成

褐飞虱总RNA抽提采用Trizol法，抽提过程中使用的EP管等均需为RNase-free。提取得到的总RNA用1%的琼脂糖凝胶电泳先检测质量，然后用NanoDrop 2000分光光度计测定提取RNA的浓度及纯度。使用PrimeScript®RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒配置体系，进行第一链cDNA的合成，合成的cDNA保存于-20℃冰箱。

1.4 dsRNA的合成

用Primer 5软件设计两个的dsRNA特异性片段并使用合成的特异性引物进行PCR扩增，产物进行T克隆，具体引物序列见表1。随后用带T7启动子的引物进行交叉PCR反应，根据T7 RiboMAXTMExpress RNAi System试剂盒的说明进行dsRNA合成，待dsRNA合成后，采用NanoDropTM2000测定合成的dsRNA浓度，同时以绿色荧光蛋白基因（）作为对照组，采用同样的方法合成的dsRNA。

1.5 褐飞虱的显微注射

用于显微注射的材料为5龄第1天的褐飞虱。首先打开显微注射仪，调节氮气压力，并在莱卡EZ4解剖镜下通过注射标准毛细管确定每次注射的dsRNA的体积（0.1 μL）。将CO2麻醉后的褐飞虱虫体腹面朝上放置于提前制备好的琼脂糖胶台的凹槽中，在莱卡EZ4解剖镜下于褐飞虱第二和第三对足间的腹基节连接处分别注射ds、ds和ds，注射量为50 ng/头。最后将注射好的褐飞虱转移至装有新鲜水稻的玻璃管中，分别在48 h后收取依然存活的褐飞虱用于后续试验。每个处理取6个平行样，其中3个平行样用于基因表达情况检测，每个平行样10头褐飞虱；另外3个平行样用于糖含量和酶活性测定，每个平行样20头褐飞虱。

1.6 RNAi后褐飞虱体内海藻糖代谢通路相关基因表达量测定

将显微注射48 h后不同组别的褐飞虱分装于3个平行管中，抽提总RNA后反转录得到3管平行的cDNA，参照SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒的方法进行qRT-PCR检测。qRT-PCR反应体系（20 μL）：10 µL SYBR Premix Ex Taq；1 μL上游/下游引物；1 μL cDNA；7 μL灭菌水。选用褐飞虱18S核糖体核糖核苷酸基因（18S ribosomal RNA，18S）作为内参基因[28]，具体引物序列见表1。qRT-PCR程序：95℃预变性10 s，95℃解链5 s，59℃退火并延伸30 s，39个循环。每个处理3个生物学重复，每个生物学重复含3个技术重复。检测基因的相对拷贝数用2-ΔΔCT方法进行分析[29]。

1.7 总糖原、海藻糖、葡萄糖含量以及海藻糖酶活性测定

取试验组以及对照组材料，加入200 μL PBS，用研磨棒充分研磨后放入超声破碎仪进行超声破碎，破碎后再加入800 μL PBS，4℃，1 000×离心20 min。取350 μL上清，4℃，20 800×超离心1 h，剩余上清用于总蛋白、总糖原和海藻糖含量的测定。超离心后的上清用于测定葡萄糖、蛋白质含量以及可溶型海藻糖酶活性，沉淀悬浮于300 μL的PBS后用于测定葡萄糖、蛋白质含量和膜结合型海藻糖酶活性。具体步骤参照Zhang等描述的方法[30]。

1.8 数据分析

应用Excel软件整理、分析数据，通过SigmaPlot 10.0和SPSS软件进行显著性分析和作图，采用One-Way ANOVA法进行差异显著性检验（＜0.05为差异显著，用*表示；＜0.01为差异极显著，用**表示）。

表1 实时荧光定量PCR和dsNlTret1、dsGFP的引物序列

T7 sequence: GGATCCTAATACGACTCACTATAGG

2 结果

2.1 NlTret1蛋白序列分析

两条（和）的开放阅读框长度分别为1 920和1 578 bp，分别编码639和525个氨基酸，预测蛋白分子量分别为69.29和58.71 kD，等电点分别为8.32和8.36（图1-A）。蛋白质疏水性预测显示NlTret1-like X1和NlTret1-2 X1的GRAVY（grand average of hydropathicity）值分别为0.313和0.354，表明这两个转运蛋白主要由疏水性氨基酸组成。二级和三级结构显示这两个NlTret1的结构均较为简单，主要为螺旋和卷曲（图1-A、1-C）。SMART分析以及三级结构预测发现NlTret1-like X1和NlTret1-2 X1分别包含12个和10个跨膜结构域（图1-B、1-C），表明它们均为跨膜蛋白。此外，保守结构域分析结果显示两者均属于MFS超家族（图1-B）。

2.2 NlTret1系统进化树

进化分析结果显示，NlTret1-like X1和NlTret1-2 X1分别与其他昆虫的Tret1-like X1和Tret1 X1聚在一支，其中NlTret1-like X1与黄蔗蚜（）、高粱蚜（）、棉蚜（）、玉米缢管蚜（）、桃蚜（）及豌豆蚜（）的Tret1聚在一支；NlTret1-2 X1则与臭虫（）和茶翅蝽（）聚在一支，表明褐飞虱的这两个Tret1与其他昆虫的Tret1具有较高的同源性，并且与同为半翅目的上述昆虫亲缘关系较近（图2）。

GenBank登录号为XP_022183984.1（NlTret1-like X1）和XP_022195528.1（NlTret1-2 X1）Initiation and termination GenBank accession numbers: XP_022183984.1 (NlTret1-like X1) and XP_022195528.1 (NlTret1-2 X1)。A：NlTret1二级结构预测Prediction of the secondary structure of NlTret1s；B：NlTret1结构域分析（蓝色方块表示跨膜结构，粉色方块表示低复杂区域）Analysis of domain of NlTret1s (Blue blocks represent transmembrane region and pink blocks represent low complexity region)；C：NlTret1三级结构预测Prediction of the tertiary structure of NlTret1s

Tret1蛋白来源物种及其GenBank登录号 Source species of Tret1 proteins and their GenBank accession numbers。豌豆蚜Acyrthosiphon pisum：ApTret1 (XP_001943832.1)、ApTret1 X1 (XP_003247868.1)；桃蚜Myzus persicae：MpTret1-like (XP_022175298.1)、MpTret1-like X1 (XP_022168826.1)；高粱蚜Melanaphis sacchari：MsTret1-like (XP_025205275.1)、MsTret1-like X1 (XP_025193454.1)；玉米缢管蚜Rhopalosiphum maidis：RmTret1-like (XP_026817841.1)、RmTret1-like X1 (XP_026807124.1)；棉蚜Aphis gossypii：AgTret1-like (XP_027847026.1)、AgTret1-like X1 (XP_027852240.1)；黑豆蚜Aphis craccivora：AcTret1-like (KAF0773727.1)；黄蔗蚜Sipha flava：SfTret1-like (XP_025415984.1)、SfTret1-like X1 (XP_025419752.1)；褐飞虱Nilaparvata lugens：NlTret1-2 X1 (XP_022195528.1)、NlTret1-like X1 (XP_022183984.1)；臭虫Cimex lectularius：ClTret1-like (XP_014254493.1)；茶翅蝽Halyomorpha halys：HhTret1-like (XP_014285740.1)；湿木白蚁Zootermopsis nevadensis：ZnTret1-like (XP_021920751.1)；第二隐白蚁Cryptotermes secundus：CsTret1 X1 (XP_023724429.1)；埃及伊蚊Aedes aegypti：AaTret1 (XP_001654366.1)；猫虱Ctenocephalides felis：CfTret1-like (XP_026477563.1)；菜粉蝶Pieris rapae：PrTret1-like (XP_022131116.1)；麦茎蜂Cephus cinctus：CcTret1 X1 (XP_015587164.1)；瘿蜂Belonocnema treatae：BtTret1-like (XP_033208929.1)；汗蜂Dufourea novaeangliae：DnTret1 (KZC12919.1)；彩带蜂Nomia melanderi：NmTret1-like X1 (XP_031847112.1)；银额果蝇Drosophila albomicans：DaTret1 X1 (XP_034103480.1)；铜绿蝇Lucilia cuprina：LcTret1 X1 (XP_023292603.1)；德国小蠊Blattella germanica：BgTret1 (PSN42188.1)；柑橘木虱Diaphorina citri：DcTret1-like (XP_026682851.1)

2.3 RNAi后褐飞虱体内两个NlTret1的表达情况

与注射ds组相比，干扰或48 h后褐飞虱体内靶标基因的表达量均极显著下降（＜0.01）（图3），ds或ds的干扰效率分别为66.38%和89.45%，表明靶标基因的干扰有效。

2.4 RNAi后褐飞虱体内海藻糖代谢通路相关基因的表达情况

与注射ds组相比，干扰48 h后褐飞虱体内、、、和的表达量均极显著下降；而在干扰48 h后褐飞虱体内、和也极显著低表达，但和的相对表达量极显著上升（＜0.01）（图4）。

2.5 RNAi后对褐飞虱体内糖原、海藻糖和葡萄糖含量的影响

与注射ds组相比，干扰48 h体内海藻糖含量极显著增加（＜0.01），而其他糖类物质含量变化均不显著。干扰48 h后，褐飞虱体内的海藻糖、葡萄糖和糖原含量均无显著变化（图5）。

图3 注射48 h后NlTret1-like X1和NlTret1-2 X1的表达量

图4 RNAi后褐飞虱海藻糖代谢通路相关基因的表达量

N.S.代表差异不显著。下同

2.6 RNAi后对褐飞虱体内海藻糖酶活性的影响

与注射ds组相比，褐飞虱体内可溶性海藻糖酶和膜结合型海藻糖酶活性在干扰48 h后均极显著下降（＜0.01），而在干扰后未出现显著变化（图6）。

3 讨论

不同昆虫的Tret具有相似的氨基酸序列，且与葡萄糖转运蛋白超家族相似，因此有研究表明Tret1可能是葡萄糖转运蛋白超家族的新成员[31]。此外，也有研究证实，嗜眠摇蚊（）Tret1不仅可以转运海藻糖，还可以转运葡萄糖类似物[21]。在葡萄糖转运蛋白（glucose transporter，Glut）超家族的几乎所有成员（包括Tret1）中都可以看到序列相似性，但它们的生化特性（例如底物选择性和动力学）差异很大，如Glut1的底物是葡萄糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖胺，而Glut5和H+-肌醇协同转运蛋白（H+-myo-inositol cotransporter，HMIT）的特定底物分别是果糖和肌醇[32]。说明除了保守区域中的氨基酸残基外，其他氨基酸残基也可能对每个转运蛋白的特异性产生影响。本研究通过生物信息学方法分析了褐飞虱的两个Tret1序列，发现它们的二级结构主要是螺旋及卷曲，且均属于MFS超家族。但其二级结构以及保守结构域外的氨基酸残基均存在差异，推测它们的海藻糖转运功能可能存在差异。此外，这两个NlTret1同其他糖转运蛋白相似，拥有较多个跨膜区域，其中NlTret1-like X1有12个跨膜区域，NlTret1-2 X1有10个跨膜区域（图1）。SAIER研究表明，MFS超家族成员蛋白的二级结构预测显示其大多都具有12次-螺旋跨膜结构域，而其他一些具有14或24次-螺旋的可能是进化过程中以12次跨膜-螺旋为基础产生的[33]。NlTret1-2 X1只具有10个跨膜区域，可能是由于所得到的片段并不是全长。

图6 RNAi后褐飞虱体内的海藻糖酶活性

海藻糖是昆虫中的主要血淋巴糖，而海藻糖转运蛋白则负责海藻糖的运输并调节海藻糖在不同组织中的分布，在昆虫的营养稳态和胁迫耐受性中起着重要作用[11-15,24]。此外，自在秀丽隐杆线虫（）的研究中首次发现RNAi现象之后，RNAi技术已成为昆虫基因功能研究、基因表达调控、害虫控制、新型农药开发等方面的有力工具[34-36]。本研究在验证基因干扰有效的前提下（图3），检测了与海藻糖代谢相关的一些基因表达情况以及部分生化指标，发现干扰后，褐飞虱体内所有的和均呈极显著低表达（图4），但的表达量高于的表达量，且可溶性海藻糖酶及膜结合型海藻糖酶的活性均极显著下降（图6），因此在干扰后，褐飞虱体内的海藻糖被积累（图5）。干扰后的表达量均显著下降且和均极显著高表达（图4），但海藻糖酶活性无明显变化（图6），推测可能是褐飞虱体内的糖原和葡萄糖在向海藻糖转化，导致褐飞虱体内的海藻糖含量无显著变化（图5）。在大猿叶虫（）中发现了两个，其中在脂肪体中高表达，且RNAi后会导致脂肪体中海藻糖含量升高；则在卵巢中高表达，然而在干扰其表达后，卵巢内的海藻糖含量却呈极显著下降趋势[37]。表明不同的Tret1可能在不同的组织或不同的生理过程中起作用。但由于大猿叶虫的研究主要针对脂肪体和卵巢组织进行，与本研究选取整个虫体存在差异，笔者推测褐飞虱的两个Tret1可能也在不同组织间发挥着不同功能，可能在特异性转运海藻糖参与能量供应中起到更为显著的作用。

4 结论

褐飞虱的两个Tret1结构均较为简单，主要为螺旋和卷曲；此外，它们均属于MFS超家族，具有较多的跨膜结构域；褐飞虱的Tret1与其他昆虫的Tret1具有较高的同源性，且与其他半翅目昆虫如黄蔗蚜等的亲缘关系较近；注射ds和ds均能有效抑制本基因的表达；ds和ds注射到褐飞虱体内，能够打破体内海藻糖代谢的平衡。推测褐飞虱的这两个Tret1可能在不同组织间发挥着不同的功能，且NlTret1- like X1在特异性转运海藻糖参与能量供应中起到更为显著的作用。

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The Structure Characteristics and Biological Functions on Regulating Trehalose Metabolism of Twoin

YU WeiDong1,2, PAN BiYing1, QIU LingYu1, HUANG Zhen2, ZHOU Tai2, YE Lin2, TANG Bin1, WANG ShiGui1

(1College of Life and Environmental Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036;2Zhejiang Dingyi Biotechnology Co., LTD, Quzhou 324100, Zhejiang)

【】Trehalose is the main blood sugar substance in insects and plays an important role in insect development and physiological activities. Among them, trehalose transporter (Tret) plays a key role in the transportation of trehalose from trehalose-producing tissues (such as fat body) to trehalose-consuming tissues. The objective of this study is to explore the biological functions of these two NlTret1s in brown planthopper () by analyzing the sequence structure of two NlTret1s and further suppressing the expression of.【】Taking these two NlTret1 sequences as the research object, the protein structure and homology with other insects were analyzed by bioinformatics technology. The RNA interference (RNAi) technology was used to inject the synthetic exogenous dsRNA (double-stranded RNA) into the laboratory feeding population of, to inhibit the expression of the. The total RNA was extracted to synthesize the first-strand cDNA using reverse transcription kit, qRT-PCR (quantitative real-time PCR) technology was used to detect the RNAi effect of dsand the expression of related genes in the trehalose metabolism pathway inafter RNAi, and finally glucose, trehalose and glycogen content as well as trehalase enzyme activity were determined.【】Bioinformatics analysis showed that the open reading frames ofandare 1920 and 1578 bp in length, encoding 639 and 525 amino acids, respectively. The predicted protein molecular weights are 69.29 and 58.71 kD, and the isoelectric points are 8.32 and 8.36, respectively. The secondary structure of NLTret1-like X1 and NLTret1-2 X1 is mainly composed of helix and coil. Conservative domain analysis showed that they all belong to the MFS family. The results of evolutionary analysis showed that Tret1 of different insects had high homology, andwas closely related to other hemiptera insects. Compared with the dsgroup, the target gene was inhibited significantly after injection with dsor ds. Furthermore, the content of glycogen and glucose indid not change significantly, but unlike the dsgroup, the trehalose content ofwas significantly increased with the injection of ds. Meanwhile, the expression of the,,,andwas significantly down-regulated after theknocked down for 48 h. The expression of,andalso decreased significantly after injection with dsfor 48 h, whileandshowed a very significant upward trend. Moreover, after injection of ds, the activities of soluble trehalase and membrane-bound trehalase were significantly reduced, but there was no significant change after injection with ds.【】These two Tret1s ofplay different functions in different tissues, among which NlTret1-like X1 plays a more significant role in the specific transport of trehalose involved in energy supply. The results are helpful to explore the regulatory mechanism of Tret1 regulating the balance of trehalose metabolism in insects or invertebrates, and provide a theoretical basis for the future control of pests by regulating blood sugar balance, such as.

brown planthopper (); trehalose transporter (Tret); structure; trehalose metabolism; RNAi