董飞　王淑芳　张笑　徐剑宏　史建荣

摘要：为进一步优化和完善小麦中主要镰刀菌毒素的固相萃取-高效液相色谱串联质谱检测法，探索了粒径和取样量对脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮检测的影响。结果表明，当粉碎粒径为20目时，脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量为1 868±115 μg/kg，除10目外，显著高于其他粒径和未粉碎样品;3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量分别为9±2 μg/kg和13±2 μg/kg，除40目外，显著高于其他粒径和未粉碎样品;玉米赤霉烯酮含量为590±15 μg/kg，显著高于其他粒径和未粉碎样品。在样品充分混匀条件下，取样量对检测结果没有显著影响，但随着取样量的增加，精密度会得到提高。因此，采用本研究方法檢测小麦中主要镰刀菌毒素时，样品应完全粉碎过20目筛;同时，可适当增加取样量，以提高检测结果的精密度。

关键词：小麦;固相萃取;高效液相色谱串联质谱;粒径;取样量;镰刀菌毒素;检测

中图分类号：S435.121.4+5   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）19-0206-04

收稿日期：2019-12-26

基金项目：国家自然科学基金（编号：31772118、31701748）;江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（17）1003]。

作者简介：董 飞（1985—），男，江苏南京人，硕士，助理研究员，主要从事农产品质量安全研究。Tel：（025）84392003;E-mail：feidong1985@126.com。

通信作者：史建荣，博士，研究员，主要从事农产品质量安全研究。Tel：（025）84392001;E-mail：jianrong63@126.com。

小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌复合群引起的一种世界性真菌病害，不仅影响小麦产量，还会导致小麦中镰刀菌毒素严重污染，对人畜健康造成危害[1-2]。脱氧雪腐镰刀菌烯（DON）及其乙酰化衍生物[3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3ADON），15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15ADON）]和玉米赤霉烯酮（ZEN）是我国小麦中最为常见的镰刀菌毒素[1，3-5]。

目前，国内外报道最多的检测真菌毒素的前处理方法主要有免疫亲和柱法[6-8]、多功能净化柱法[3，9]和固相萃取法[10-12]，其中前两者价格昂贵，相比较而言，固相萃取法是一种可同时检测小麦中多种镰刀菌毒素的廉价高效的前处理方法。但长期以来，在采用该方法作为前处理方法时，国内外研究学者比较重视样品的提取净化和仪器分析工作，而对样品制备的研究严重缺乏。研究表明，样品制备过程尤其是样品的粉碎粒径对检测结果的准确性有直接影响[13-14]。此外，样品粉碎后，分析样品的取样量对分析误差也会产生影响[13]。本研究在前人的检测方法的基础上，进一步明确粒径和取样量对定量检测结果的影响，对优化和完善小麦中主要镰刀菌毒素的固相萃取-高效液相色谱串联质谱检测方法具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

主要仪器有：高效液相色谱仪20ADXR，日本岛津公司;质谱仪AB6500，美国AB公司;旋风粉碎磨，杭州钱江仪器设备有限公司;固相萃取仪Visiprep 24TM DL，美国Supelco公司;离心机5810R，德国Eppendorf公司;氮吹仪N-WVAPTM 112，美国Organomation公司;电子天平YP3002，上海佑科仪器仪表有限公司;电子天平BT125D，德国Satorius公司;氨基固相萃取柱，500 mg，6 mL，上海安谱科学仪器有限公司;0.22 μm有机滤膜，天津市津腾实验设备有限公司。

主要试剂有：DON、3ADON、15ADON、ZEN标准品，纯度≥99%，Romer国际贸易（北京）有限公司;乙腈和甲醇，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司;甲醇，色谱纯，德国Merck公司;乙酸铵，色谱纯，美国Tedia公司;试验用水为Milli-Q超纯水，美国Millipore公司。

1.2 液相色谱条件

色谱柱为WatersAtlantis T-3色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）。流动相：A为水（含5 mmol/L 乙酸铵），B为甲醇。采用线性梯度洗脱，0～2 min，流动相中水相（A）比例由75%下降到30%;2～4 min，流动相水相（A）比例由30%下降到10%;4～6 min，保持流动相中水相（A）比例为10%;6～9 min，流动相中水相（A）比例由10%上升至75%;10～15 min，保持流动相中水相（A）比例为75%。流速为0.7 mL/min，单次运行时间总共为15 min。

1.3 质谱条件

离子化模式为电喷雾电离正离子模式（ESI+），检测方式为多反应监测（MRM），离子源温度为500 ℃，驻留时间100 ms，雾化气压34.5 kPa，辅助气压34.5 kPa，喷雾电压5 500 V，碰撞室射出电压6 V。4种镰刀菌毒素的质谱参数见表1。

1.4 样品提取净化

样品的提取净化采用优化Njumbe的方法[10]，将小麦粉碎至完全通过20目筛，准确称取均质样品5.0 g，加入4倍样品质量体积（20 mL）的乙腈-水（V ∶V，80 ∶20），在180 r/min摇床上振荡30 min，3 200 r/min 离心15 min后取上清，转移到新的容器中，待净化。将氨基固相萃取柱连接在固相萃取仪上，分别用5 mL甲醇和甲醇-水（V ∶V，80 ∶20）活化。准确移取5 mL 待净化的上清液加入固相萃取柱中，以约1 s/滴的流速通过固相萃取柱，收集过柱液，向固相萃取柱中加入10 mL 甲醇-水（V ∶V，80 ∶20）洗脱，收集全部洗脱液，合并过柱液和洗脱液于干净的玻璃试管中，用氮气吹干，向残留物中加入1 mL流动相溶液，于涡旋混合器上振荡1 min，过0.22 μm有机滤膜，供高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）检测。

1.5 基质标准曲线的建立

按照SN/T 3136—2012和GB 5009.111—2016中的方法[15-16]对从市场购买的小麦样品进行检测，取未检出DON、3ADON、15ADON、ZEN的空白小麦样品，粉碎至完全通过20目筛。准确称取5.0 g空白样品，加入50 mL具塞三角瓶中，采用“1.4”节的方法提取净化，将DON、3ADON、15ADON、ZEN标准品用上述空白基质稀释成混合标准溶液。

1.6 本研究方法的回收率测定

采用本研究建立的方法对添加4种镰刀菌毒素的小麦样品进行检测，并测定回收率。分别在空白小麦样品中添加4种镰刀菌毒素，使DON浓度分别为10、20、100 μg/kg;3ADON和15ADON浓度分别为5、10、50 μg/kg;ZEN浓度分别为3、6、30 μg/kg。试验设3次重复。

1.7 数据分析

用Microsoft Excel 16.0软件处理数据，用SPSS（IBM）19.0软件进行数据统计分析。计算回收试验中4种镰刀菌毒素的回收率平均值和相对标准偏差（RSD）;计算不同粉碎粒径和取样量条件下4种镰刀菌毒素含量的平均值、RSD及差异显著性等。

2 结果与分析

2.1 试验方法的线性范围与灵敏度

取空白小麦样品进行提取净化，将DON、3ADON、15ADON、ZEN标准品用空白基质稀释成混合标准溶液，其中，DON系列标准工作液浓度为10、30、120、600、1 200 μg/kg;3ADON和15ADON系列标准工作液浓度为5、10、50、100、200 μg/kg;ZEN系列标准工作液浓度为3、6、12、30、60、120 μg/kg。以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）作线性回归方程，根据3倍信噪比的峰响应值得到本研究方法的检出限，根据10倍信噪比的峰响应值得到线性范围的下限。结果显示，DON、3ADON、15ADON、ZEN线性范围分别为10～1200、5～200、5～200、3～120 μg/kg;基质标准曲线相关系数（r）分别为0.999 9、0.999 7、0.999 8、0.999 9;检出限（LOD）分别为5、2、2、1 μg/kg;定量限（LOQ）分别为10、5、5、3 μg/kg。

2.2 试验方法的回收率

采用本研究方法对添加4种镰刀菌毒素的小麦样品进行检测，结果（表2）表明，DON的加标回收率为87.5%～94.2%，RSD为5.4%～7.2%;3ADON的加标回收率为86.9%～93.2%，RSD为5.3%～6.8%;15ADON的加标回收率为88.4%～95.2%，RSD为4.8%～7.5%;ZEN的加标回收率为88.5%～96.6%，RSD为4.5%～5.8%。

2.3 粒径对镰刀菌毒素检测结果的影响

按照SN/T 3136—2012和GB 5009.111—2016中的方法[15-16]对2016年江苏省新收获小麦进行检测，筛选得到DON、3ADON、15ADON、ZEN含量分别为1 950、12、14、610 μg/kg的小麦样品。将筛选得到的小麦样品充分混匀，采用四分法混合缩分，分别粉碎至完全通过10、20、40、60目筛后待用，以未粉碎的小麦样品为对照，待检测小麦样品于4 ℃保存。

采用“1.4”節中的方法对不同粒径和未粉碎小麦样品进行提取净化及HPLC-MS/MS检测，试验设5次重复，检测结果如表3所示。当粉碎粒径为20目时，DON含量为1 868±115 μg/kg，除与10目没有显著差异外，显著高于其他粒径和未粉碎样品;3ADON、15ADON含量分别为（9±2）、（13±2） μg/kg，除与40目没有显著差异外，显著高于其他粒径和未粉碎样品;ZEN含量为（590±15） μg/kg，显著高于其他粒径和未粉碎样品。总体而言，在检测小麦中DON、3ADON、15ADON、ZEN的含量时，应将小麦粉碎至完全通过20目筛。

2.4 取样量对镰刀菌毒素检测结果的影响

取“2.3”节中完全粉碎通过20目筛的小麦样品，充分混合均匀，采用“1.4”节中的方法对不同取样量小麦样品进行提取净化及HPLC-MS/MS检测，试验设5次重复，比较取样量大小对4种镰刀菌毒素检测结果的影响，结果如表4所示。DON、3ADON、15ADON、ZEN含量在不同取样量间没有显著差异;但是随着取样量的增加，样品重复之间的RSD呈下降趋势，精密度会得到提高，这一结果与前人研究结果[13]相一致。因此，在样品充分混匀的情况下，可适当增加样品的取样量。

3 讨论

研究发现，采用固相萃取-高效液相色谱串联质谱法检测小麦中DON、3ADON、15ADON、ZEN含量时，样品粉碎粒径对4种镰刀菌毒素的定量检测有显著影响，应将小麦粉碎至完全通过20目筛。取样量对4种镰刀菌毒素的检测结果没有显著影响，但是对精密度会有影响;在条件允许的情况下，可适当提高取样量。目前，国际上对真菌毒素分析过程中的样品制备高度重视[17]，并呼吁制定统一的样品制备标准程序。但国内长期以来比较重视样品提取净化和仪器分析工作，对样品制备的研究比较缺乏，部分检测方法标准对样品粉碎粒径或取样量规定不够明确[15-16，18]。因此，在制订检测方法标准时，应明确样品制备要求，引入具备一定功能的样品粉碎设备，进而逐步提高我国主粮产品中真菌毒素检测能力。

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