魏文豪，杨雅婷，白亚娟，魏一杰，杨文龙，周瑞金

（河南科技学院园艺园林学院，河南新乡 453003）

君迁子（Diospyros lotus L.）又称黑枣、软枣、牛奶枣、野柿子、丁香枣，果实药食兼用，具有很高的营养价值[1]。君迁子树势强健，树干挺直，树冠圆整，适应性强，根系发达，寿命长[2]，可作为柿树砧木[3]和园林绿化树种。目前君迁子主要以种子繁殖为主，但种子发芽率低（约为37.4%）[4]，育苗季节受限，且遗传稳定性差，不能满足苗木市场需求。为了满足生产对君迁子无性系苗木的需要，研究君迁子无性系快繁技术就显得非常必要。目前关于君迁子组织培养方面报道不多[5-8]，主要是以休眠芽[7,8]为外植体，但存在表面灭菌困难、初代接种诱导慢、褐化严重、增殖率低等问题，直接影响其在生产中的应用。本研究以君迁子不同时期的芽为外植体，探讨消毒方式和时间、抗褐化剂的添加等对启动培养的影响，旨在为君迁子组培体系的优化和完善提供理论基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

外植体取自河南省新乡市森林公园10年生君迁子实生树。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的采集与预处理。在晴天中午剪取当年萌发的健壮枝条，先用自来水冲洗外植体的表面，洗涤剂溶液浸泡20min，并用试管刷刷洗材料表面，自来水冲洗，将枝条剪成单芽茎段后，在超净工作台上对外植体进行灭菌处理。

1.2.2 外植体的灭菌。在超净工作台上，先用75%酒精对外植体进行表面灭菌30s，无菌水冲洗1～2次，再将外植体置于0.1%升汞分别灭菌4min、6min、8min，或1%次氯酸钠分别灭菌10min、12min、15min（灭菌过程中不断振荡），用无菌水冲洗5～6次（每次2min），最后用无菌滤纸吸干外植体表面水分，接种时将茎段（带芽）两端直接接触升汞的部位切掉，剪成1～2cm长，按生长方向插入相应培养基培养。

1.2.3 外植体取材时间和部位。分别在2019年11月、2020年4月各采集休眠芽和萌动芽为外植体，按外植体灭菌所得的最佳消毒方法处理，将外植体接种在相应的培养基上。

1.2.4 培养基处理。以改良的（1/2N）MS+ZT 0.5mg/L+IAA 0.01mg/L为基本培养基，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH值为6.5。在基本培养基上选取2种不同浓度的抗褐剂：活性炭（0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L）、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）（0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L）；每个处理接种30个，重复3次，每3d观察试验结果，当培养基出现褐化情况时转瓶，培养3个月后统计植株的苗高及增殖系数，并观察其生长势，确定最适生长培养方案，进行防褐化效果的研究。

1.2.5 培养条件。光照时间16h/d，培养温度（25±2）℃，光照强度2000Lx，室内相对湿度控制在75%左右。

1.2.6 统计方法。污染率（%）=（污染个数/接种个数）×100；存活率（%）=（存活个数/接种个数）×100；死亡率（%）=（死亡个数/接种个数）×100；萌芽率（%）=（萌芽的外植体数量/接种的外植体数量）×100；增殖系数=转接得到的外植体数量/原接种的外植体数量；丛生苗率（%）=（产生侧芽的外植体数量/接种的外植体数量）×100。

1.2.7 数据分析。试验结果数据采用Microsoft Excel 2003软件进行作图；用DPS统计软件进行方差分析和Duncan多重比较分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌剂和灭菌时间对外植体污染率和死亡率的影响

合适的灭菌材料和灭菌时间既能充分灭菌，又不会将外植体杀死。从表1可以看出，使用升汞灭菌时，污染率随灭菌时间的增加而降低，灭菌4min时污染率为34.4%，死亡率为1.1%；当灭菌时间达8min时，污染率下降到7.8%，但同时外植体死亡率增至53.3%。综合分析，灭菌6min较为适宜。而次氯酸钠灭菌10min的效果不佳，其污染率（45.6%）和死亡率（11.1%）都最高，灭菌15min的污染率（24.4%）和死亡率（1.1%）最低，说明1%次氯酸钠灭菌15min最佳。综合比较，升汞灭菌效果优于次氯酸钠，但升汞属于剧毒药品，废液如处理不当，对环境污染严重，建议使用1%次氯酸钠灭菌15min。

表1 不同灭菌剂和灭菌时间对外植体污染率和死亡率影响

2.2 不同外植体对启动培养的影响

以休眠芽和萌动芽为试材，初代启动培养，从表2可以看出，取材时期不同，接种后的外植体萌芽率不同。诱导丛生芽最适宜的取材时期是萌动芽，萌芽率可达71.0%，而休眠芽的萌芽率仅为3.7%，污染率在2个处理之间也存在一定差异，休眠期的芽在芽鳞片包被紧密，灭菌困难，外植体污染相对较严重。休眠芽在培养初期，丛生芽增殖现象并不明显，且容易未萌发后期干枯死亡现象。综合考虑，以萌动芽作为外植体便于操作，利于后期培养。

表2 取材部位对外植体污染率影响

2.3 抗褐化剂对启动培养中外植体生长情况的影响

从表3可知，添加不同浓度的抗褐化剂对外植体生长均有一定调节作用，其中PVP更有利于组培苗的增殖，添加后丛生现象明显；而活性炭对组培苗生长势影响较突出，添加活性炭后组培苗叶片较大，颜色浓绿。活性炭和PVP处理效果显著优于对照，均可有效降低外植体的褐化率，且出现褐化的时间也有所延后。活性炭在0.5g/L时组培苗生长最好，平均苗高4.3cm，但出现丛生现象不多，增殖系数低；1.0g/L时组培苗基本没有褐化现象。培养基中添0.5g/L PVP后，组培苗丛生率最高，平均苗高4.5cm，有利于组培快繁，褐化率26.6%，是最佳的添加浓度。综合比较分析，在启动培养基中添加0.5g/L的PVP最为适宜。

表3 抗褐化剂对外植体生长情况的影响

3 结论与讨论

不同取材时期的外植体其萌芽率和增殖能力存在差异，休眠芽处在休眠阶段，接种后萌发率较低；春季待萌发的饱满腋芽处于芽体萌动期，接种后较容易培养且增殖能力较强。

君迁子在组织培养过程中褐化现象严重，在培养基中加入抗褐化剂可有效降低褐化率。PVP、活性炭是植物组织培养中常用抗褐化剂[9]，本试验在培养基中加入PVP可以减轻外植体的褐化，而且长势良好，其中以0.5g/L的添加量效果最好。而活性炭的添加更利于组培苗的伸长生长，抗褐化效果最好，但丛生率相对低。有研究认为，活性炭不仅会吸附培养基中的酚类物质，而且会吸附培养基中的植物生长调节剂及营养物质，从而影响外植体长势[10]。但在本研究中，君迁子在添加活性炭的培养基中长势很好，且在多次继代培养后出现生根现象。

综上所述，君迁子启动培养最佳取材时期在春季芽萌动期，用1%次氯酸钠灭菌15min，培养至添加0.5g/L PVP的（1/2N）MS+ZT 0.5mg/L+IAA 0.01mg/L启动培养基中，成活率最高，启动培养效果最佳。