侯伟丽，马兰

(哈尔滨医科大学附属第二医院老年病科，哈尔滨 150001)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以记忆衰退和认知功能下降为特征的神经退行性疾病，其病理主要表现为淀粉样斑块沉积、神经元变性、突触损伤等。AD发病机制目前尚不明确，可能有多种因素参与，如炎症、氧化应激、线粒体障碍、基因突变、环境等。研究发现microRNA功能异常与AD的发病机制密切相关。

1 microRNA通过抑制靶mRNA调控基因表达

microRNA(miRNA)[1,2]是一种内源性非编码基因，在高等真核生物中起着转录后调控和基因信息表达的作用，主要作用模式是通过识别结合靶信使RNA(mRNA)的3′-untranslation region (UTR)上的互补核糖核苷酸序列抑制mRNA的表达， 参与调控。

每一个miRNA[3]都有可能同时对应数百个基因编码的mRNA，大多数miRNA表现出严格调控的表达模式，这种表达模式通常是组织特异性的，甚至是细胞特异性的，强调了miRNA在特定基因表达模式的时间、空间和发育阶段中的重要性。miRNA作为介导基因表达的mRNA的负调控因子而发挥作用，因此，上调miRNA可能会下调它们的靶mRNA，并下调这些mRNA编码的遗传信息的表达。神经系统中的miRNA形成一个复杂的基因表达调控网络，不仅包含正常的生理调控信息，还包含丰富的与神经退行性疾病(如AD)相关的神经生物学信息。后文从miRNA调节Aβ蛋白生成、参与突触损伤及AD病理改变影响miRNA正常表达3个方面阐述miRNA与AD的相互关系。

1.1 microRNA调节Aβ蛋白的生成

Aβ淀粉样斑块沉积在神经组织周围是AD的病理特征之一，淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid protein precursor，APP)是Aβ的前体蛋白，BACE1 (β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme)是将APP裂解为Aβ的一种裂解酶，目前，大多数研究表明miRNA主要通过与BACE1的 mRNA 3′-UTR结合来调控BACE1[4]。Lei等[5]研究发现miR-29c在AD患者体内明显下调，并在转染miR-29c的人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞实验证实miR-29c与BACE1 mRNA的3′-UTR结合使BACE1表达增加，BACE1表达增加直接促成Aβ生成。Long等[6]发现，从AD患者分离的脑标本中miR-339-5p水平显著降低，BACE1mRNA的 3′-UTR有2个miR-339-5p结合位点，使用miR-339-5p模拟类似物可以显著抑制人胶质母细胞瘤细胞和人脑原代培养物中BACE1蛋白的表达。Wang等[7]发现miR-200a-3p通过3个自身非翻译区调节BACE和蛋白激酶cAMP-活化催化β亚基(PRKACB)的蛋白易位，从而减少Aβ和P-tau蛋白的产生，并且在体外培养细胞中miR-200a-3p的保护功能被过度表达的BACE1或PRKACB逆转，认为miR-200a-3p可能通过BACE1或PRKACB参与AD病理过程。miRNA还可与mRNA 3′-UTR结合，调节APP的表达。Liu等[8]测量了APP/PS1双转基因小鼠样本、轻度认知功能障碍(mild cognitive impairment，MCI)患者及AD患者脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)中的miR-193b，发现miR-193b过表达可抑制APP的mRNA和蛋白表达,使用miR-193b的低聚核苷酸抑制剂可诱导APP上调，并且发现AD患者及MCI患者CSF中miR-193b均下降，在AD患者CSF中miR-193b和Aβ42呈负相关。另外，Lu等[9]发现在 APP/PS1小鼠中miR-138通过抑制ADAM10(一种解离素和金属蛋白酶)的表达，促进β淀粉样蛋白(Aβ)生成，诱导突触功能、学习记忆功能下降，而过表达的sirtuin 1(Sirt1)可改善miR-138对ADAM10的抑制。同时实验者发现在Aβ-oligomer-treated N2a细胞的细胞质中circRNAHDAC9 (circHDAC9)和miR-138两者表达呈负相关，CircHDAC9充当了miR-138的缓冲体，减少了miR-138的表达，并扭转了sirtuin1和Aβ过表达的局面，并且发现AD患者和MCI患者血清中circHDAC9均降低。

1.2 microRNA参与突触损伤

突触损伤是AD的另一病理改变，研究表明突触后蛋白SHANK3细胞骨架存在缺陷可导致突触结构和功能的破坏，可能至少部分是通过诱导核转录因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)调控的促炎miR(如miR-34a)介导的。Zhao等[10]研究发现散发AD患者脑部上颞叶上皮层内miR-34a显著上调，突触后元件富含脯氨酸的SH3和多锚蛋白重复结构域SHANK3蛋白显著下调。生物信息学、microRNA芯片分析和SHANK3-mRNA-3′UTR荧光素酶报告基因检测证实了miRNA-34a在调控人类神经胶质细胞SHANK3表达中的重要性。另外突触后支架蛋白SHANK3和TSPAN[11,12]蛋白水平下调可能共同导致神经精神疾病的神经退行。TSPAN蛋白[13,14]是四聚体蛋白(TSPAN)超家族，通常参与组织细胞间的相互作用、膜转运、区隔以及复杂蛋白网络的形成，称为“四聚体蛋白网”，具有神经活动依赖性突触形成和可塑性的功能，并参与神经和视网膜变性。Jaber等[11]研究散发性AD海马CA1 RNA池，提出了AD中miRNA-mRNA偶联信号网络的改变，发现上调miR-34a和miR-146a参与了SHANK3和TSPAN-12的下调。Zhao等[15]发现NF-κB敏感的miR-34a可能通过调节小胶质细胞TREM2蛋白表达的下调而诱导炎症性神经变性。四聚体蛋白(TSPAN)[16]还可以调节Aβ前体蛋白(APP)的降解。

1.3 AD病理改变影响microRNA正常表达

Sierksma的团队[17]检测APPtg (APPswe/PS1L166P)小鼠和TAUtg (THY-Tau22)小鼠海马区的miRNA变化，发现6种miRNA (miR-10a-5p,miR-142a-5p, miR-146a-5p,miR-155-5p,miR-211-5p,miR-455-5p)都上调，并且其中4个(miR-142a-5p、miR-146a-5p、miR-155-5p和miR-455-5p)在AD患者脑组织海马区也发生改变，然而，在其野生型幼鼠(APPwt和TAUwt)中上调这些miRNA并不会引起与AD相关的认知障碍，说明Aβ和tau蛋白会干扰神经中某些miRNA的正常调控功能。大量研究[18,19]分析了AD患者大脑中miRNA的表达水平，发现海马、额叶皮质、小脑、脑脊液等脑组织中miRNA表达水平会随着AD的进展而改变。

2 体外实验证实调节microRNA表达可以改善认知损伤

Duan等[20]在AD小鼠模型中发现miR-25通过核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)信号通路下调Krtippel样转录因子(krtippel-like transcription factor，KLF2)，加重海马神经元损伤，促进细胞凋亡，但同时miRNA也可以具有保护神经组织的作用，如Yang等[21]对注射Aβ25-35的模拟AD大鼠进行研究发现miR-196a下调，向AD大鼠注射miR-196a可以改善AD大鼠的认知功能障碍，并且上调的miR-196a通过下调LRIG3激活PI3K/Akt通路，减轻海马组织神经元损伤，改善AD的认知损伤。Kumar等[22]通过荧光素酶报告基因检测证实了miR-455-3p与APP基因的3′UTR结合，继而在转染miR-455-3p的突变APP细胞中发现突触基因的mRNA和蛋白水平均升高，线粒体数量减少，但线粒体长度增加，并观察到miR-455-3p可降低线粒体分裂蛋白(DRP1和FIS1)的表达，增加融合蛋白(OPA1、Mfn1和Mfn2)的表达。基于这些观察，作者猜想miR-455-3p可以调控APP，并对突变的APP诱导的AD线粒体和突触异常具有保护作用。

Zhao的研究组[15]在原代培养的应激性人类神经胶质细胞(human neuroglial cell，HNG细胞)中发现TREM2下调，添加一种AM-34a可以将TREM2的下调挽救至稳态水平，抗miRNA(adeno-associated viral vector, AM)在提高我们对炎症性神经退行性疾病发病机制的认识和制定有效的基于AM的治疗策略方面的潜力可能是巨大的。在散发性AD患者新皮质和应激性HNG细胞原代共培养中[23-25]，促炎miR-146a均显著上调，在初步实验中，利用病毒载体传递(adeno-associated viral vector, AVV)系统进行抗miR-146a(AM-146a)的治疗策略，可以提高衰老5xFAD AD模型小鼠的认知功能。

3 通过外泌体可以提高microRNA的检测率

研究发现外泌体可以保留神经细胞分泌的形态学，其中包括分泌的miRNA，故通过外泌体可以提高miRNA的检测率，为进一步研究提供便利。外泌体[26,27]是一种从所有细胞中脱落的内胚体衍生的小泡，含有原细胞的各种分子成分，包括脂类、蛋白质和核酸，这些成分随细胞的健康状况和病理状态而变化。神经细胞[26]能够在生理和病理条件下分泌外泌体，其中核酸和蛋白质的变化能够作为某种状态的功能表征，外泌体可以保留神经细胞分泌的形态学这一特征使得外泌体介导的miRNA成为AD的一个重要的生物标志物。神经系统源性外泌体(neuronal derived-exosomes，NDEs)[28]可通过免疫吸附方法分离并使用ELISA从血浆中测得。这种对外泌体亚群的创新性分离[29]引起人们对使用NDEs作为AD等神经退行性疾病的生物标志物的兴趣，从血浆样本中富集NDEs的能力使得分析与AD发病机制相关的多种神经递质蛋白成为可能。

Goetzl等[30]2016年通过连续沉淀和免疫化学吸附方法，发现人血浆中富集的星形胶质细胞衍生外泌体(astrocytes derived-exosomes，ADEs)含有比血浆NDEs高得多的星形胶质细胞生物标志物——谷氨酰胺合成酶和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)，并发现AD患者ADEs中BACE-1和sAPPβ水平显著高于对照组；2018年发现AD患者A1型星形胶质细胞来源的ADEs中C4b和Bb浓度的升高[31]，结果支持A1型星形胶质细胞来源的经典和替代炎性补体途径参与C3b和C5b-C9 TCC的产生，表明A1型星形胶质细胞可能产生炎症介质，并通过ADEs将其传递给其他中枢神经系统(central nervous system，CNS)细胞，导致了神经元和突触的损害。Fernandes等[32]证明，转染瑞典突变体APP695 (SHSwe)的SH-SY5Y细胞显著表达炎症标志物以及APP和Aβ1-40，APP和Aβ1-40引起的炎症介质会触发时间依赖性的小胶质细胞活化表型,最终导致miR-21外泌体穿梭。这项工作有助于更深入地了解不同类型细胞的外泌体都可能作为AD神经炎症介质的载体，同时也揭示外泌体是神经炎症的参与者和影响者之一。

4 结 语

microRNA在AD的调控机制研究更细化、更深入，调控通路愈加明朗，外泌体作为miRNA载体为血液检测miRNA提供更精确结果，为血液检测AD生物标志物提供平台。随着对外泌体介导的神经通路理解的加深，利用外泌体将某些治疗性核酸转运到受体细胞可能成为AD的一种潜在治疗途径。因microRNA有严格调控表达模式，未来可以探索在AD不同病程阶段(如无症状期、轻度认知功能障碍期及痴呆期)、大脑不同部位miRNA表达浓度的改变以及相应的调节通路是什么，只是这将是庞大、复杂、连续且困难的工作，科学探索任重道远，期待新的发现。