丁趁趁，梁 芳，梁 荣，霍清萍

脑血管病是世界上主要致死性疾病之一[1]。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是所有脑血管意外事件发生的病理基础，是以脂质沉积、炎性细胞浸润为特征的慢性炎症性疾病。核转录因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是诱导炎性因子表达的关键调节因子，与动脉粥样硬化病变有关[2]， Kappa B 抑制蛋白(inhibitory kappa B，IκB)是NF-κB的主要调控抑制剂。稳消方由地龙、水蛭、牡丹皮、郁金、丹参、半夏6味中药组成，具有活血化瘀、行气通络、化痰利湿之功效，前期动物研究表明，稳消方可降低动脉粥样硬化模型兔的血脂指标，调节血脂代谢；抑制炎性因子及纤维蛋白原(fibrinogen，FIB)的表达[3-6]。临床研究证实，稳消方可改善血脂代谢、减少炎性因子的表达及降低血黏度、踝臂指数、动脉内-中膜厚度[7-13]。NF-κB是过氧化物酶体增殖物受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)激动剂的重要靶分子，在炎症反应基因的活化中作用突出。PPARγ通过调控NF-κB表达来抑制细胞因子、趋化因子和黏附分子等炎性因子表达和炎症反应，从而影响动脉粥样硬化形成[14]。前期动物实验证实，稳消方可激活PPARγ信号通路，上调PPARγ蛋白表达水平，抑制NF-κB p65水平表达，抑制炎症反应，具有稳定斑块的作用[15]。IκB是NF-κB的主要调控抑制蛋白，IκB的生成和降解与NF-κB的活化密切相关，IκB可通过抑制NF-κB炎症途径的激活减少血管损伤和内皮细胞活化，抑制炎性因子的表达[16]。本研究通过高脂饲料建立实验兔腹主动脉粥样硬化模型，观察Kappa B 抑制蛋白α(IκBα)与NF-κB蛋白表达水平，探讨稳消方改善实验兔动脉粥样硬化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取清洁级新西兰大白兔38只，雌雄各半，月龄3～4个月，体质量2.2～2.5 kg，购自上海松江车墩实验动物良种厂[许可证号：SCXK(沪)2017-0011]，饲养于上海中医药大学实验动物中心，动物房相对湿度为50%，室温维持在20～24 ℃，每日光照时间为07：00～18：00，饲养条件为2级。

1.2 药品和试剂 高脂饲料：普通食料91%、蛋黄粉5%、猪油3%、胆固醇1%，由上海中医药大学动物实验中心代订购。稳消方免煎颗粒：地龙、水蛭、牡丹皮、郁金、丹参、半夏按3∶3∶3∶3∶3∶2比例配伍而成，由江阴天江药业有限公司生产，生产批号：1709066。辛伐他汀：商品名舒降之，默沙东公司提供，生产批号：J20130068。

抗体：Ⅰ抗IκBα(美国Cell Signaling Technology公司生产，批号17548)，NF-κB p65(上海碧云天生物技术有限公司生产，批号082418180824)，β-actin(英国Abcam公司生产，批号GR70927-6)；Ⅱ抗：山羊抗兔HRG抗体，山羊抗小鼠HRG抗体，兔二步法检测试剂盒，小鼠二步法检测试剂盒(北京中杉金桥生物公司生产，批号分别为109534、109147、K185209A、K184312A)。苏木精-伊红(HE)染色试剂盒，SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒，BeyoECL Moon 特超敏ECL化学发光试剂盒，PVP封片液(上海碧云天生物技术有限公司生产，批号分别为082917180312、091317170911、101617171013、081617170911)；二氨基联苯胺(DAB)显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司生产，批号K187721A)；总蛋白提取试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司生产，批号P1033)；BCA蛋白定量试剂盒(北京康为世纪生物技术有限公司生产，批号20314)。

1.3 仪器 VARIOSKAN FLASH 酶标仪、PLUS新型-86 ℃超低温冰箱购自美国Thermo Scientific Revco公司，Haier医用冷藏箱购自青岛海尔特种电器有限公司，DP73+standard 1.6型显微镜摄像CCD照相系统购自日本Olympus公司，Power PAC Basic 电泳仪、chemidocTM XRS+with imagelabTM software型凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司，RH BASIC S25加热磁力搅拌器购自德国IKA仪器设备有限公司，Leica RM2016切片机购自德国徕卡公司，PPJ-A型漂片机购自常州市中威电子仪器有限公司，DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱购自上海浦东荣丰科学仪器有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 分组、造模 将38只清洁级新西兰大白兔随机分为空白组(9只)和造模组(29只)，每只实验兔每日分别给予150 g标准饲料和100 g高脂饲料喂养，其余由标准饲料补足，所有动物均单笼饲养，自由饮水，喂养12周。

1.4.2 药物干预 造模成功后，采用随机分组法[17]将造模组随机分为模型组、稳消方组和辛伐他汀组，每组9只，全部实验兔以标准饲料喂养，根据人与动物用药比例进行折算[18]，计算实验兔用量，稳消方中半夏383.33 mg/kg，地龙、水蛭、牡丹皮、郁金、丹参各575 mg/kg；辛伐他汀0.77 mg/kg，用蒸馏水溶解，混匀后灌胃；模型组灌胃生理盐水10 mL/kg。灌胃治疗8周后取材。

1.4.3 取材 实验第20周取材，于取材前夜禁水、禁食12 h，新西兰大白兔以戊巴比妥钠1.3 mL/kg麻醉后，仰卧位固定，腹主动脉采血处死，无菌条件下，顺血管走向，仔细分离血管周围的结缔组织，以左右髂动脉分叉为参照，在腹主动脉至髂总动脉分叉处向上留2 cm剪取血管。用氯化钠溶液将标本冲洗后，迅速取出一侧腹主动脉置于4%多聚甲醛固定，进行病理检查，另一侧腹主动脉放入液氮迅速冷冻，随后于-80 ℃冰箱冻存，进行相关蛋白检测。

1.4.4 腹主动脉病理学检查 组织经常规脱水透明和石蜡包埋后，以4 μm厚度切片，60 ℃烘片2 h，新鲜二甲苯脱蜡3次，每次25 min，梯度乙醇(100%、90%、85%、70%)水化，每次10 min，蒸馏水浸泡冲洗2 min。洗耳球吹去多余水分，苏木精染色液着色4 min，浸自来水10 min，洗去多余染色液。浸蒸馏水5 s，95%乙醇5 s，伊红染色液着色3 min。70%乙醇脱水2次，每次5 min，95%乙醇脱水2次，每次5 min，新鲜二甲苯透明2次，每次10 min。取出切片，通风橱内风干，以PVP封片液封片，留待镜检。

1.4.5 免疫组化法(IHC)检测 石蜡切片常规脱腊，乙醇梯度水化后，将样本玻片浸没于枸橼酸钠溶液(0.01 mol/L，pH6.0)中，微波炉高火4次，每次5 min，进行抗原修复；0.01 mol/L 磷酸缓冲盐溶液(PBS)漂洗3次，每次5 min；0.3%Triton破膜，37 ℃孵育30 min；0.01 mol/L PBS漂洗同前，加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育20 min；蒸馏水浸洗1 min，0.01 mol/L PBS漂洗如前；根据组织大小，滴加适量碧云天QuickBlockTM封闭液，室温封闭20 min；滴加一抗IκBα(1∶100)、NF-κBp65(1∶50)，4 ℃湿盒内孵育过夜；室温复温1 h，橡胶洗耳球吹去多余液体，滴加适量增强酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，37 ℃孵育30 min；0.01 mol/L PBS漂洗如前；加入适量新鲜配制的DAB显色液，暗室室温孵育6 min；自来水浸洗1 min，蒸馏水浸洗2次，每次1 min；苏木精染色液着色4 min，浸自来水10 min，洗去多余染色液。浸蒸馏水5 s，如前法行常规透明封片。

1.4.6 蛋白质免疫印迹法(Western Bolt)检测 超高速离心机低温预设4 ℃，按照每100 mg组织加入0.5 mL裂解液开始匀浆，混悬摇匀，离心机内静置10 min，每0.5 mL裂解液加1 mL抽提试剂，混悬摇匀，离心机内静置10 min，以离心力10 000 g 离心10 min，溶液分为上下两相，中间为蛋白膜。小心吸弃上下层液体，蛋白膜4 ℃静置干燥。2%十二烷基磺酸钠(SDS)溶解蛋白膜，BCA法蛋白定量。蛋白溶液和4×蛋白上样缓冲液(含DTT)以4∶1混匀后100 ℃水浴变性10 min。每孔等量加入15 μg样本蛋白溶液，80 V电压开始SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，各上样孔溴酚蓝指示剂行至浓缩胶和分离胶交界而呈一水平直线，调至120 V电压，至溴酚蓝指示剂位于胶版底部即终止电泳。加入4 ℃预冷的1×半干转缓冲液，70 V转膜2 h，取出蛋白膜，1×TBST漂洗3次，每次5 min，加入碧云天QuickBlockTM封闭液，室温封闭25 min；滴加一抗IκB α(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶500)和β-actin(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜；室温复温1 h，滴加山羊抗兔HRG抗体、山羊抗小鼠HRG抗体(均为1∶5 000)，室温摇床孵育1 h。1×TBST漂洗同前，滴加适量碧云天BeyoECL Moon极超敏ECL工作液并使其均匀覆盖在蛋白膜上，静置1 min，吸弃BeyoECL Moon工作液，暗室显影，Bio-Rad凝胶成像仪拍照记录。

2 结 果

2.1 腹主动脉组织形态 HE染色镜下可见，细胞核蓝染，胞浆呈粉红色或红色。空白组显示正常动脉结构，内膜光滑完整，血管膜层分界清楚，平滑肌细胞排列整齐，主动脉内膜未见增厚，无斑块形成。模型组内皮细胞增生，内膜变厚，脂质堆积，泡沫细胞积聚，平滑肌细胞排列不规则，血管壁上动脉粥样硬化斑块大量形成。与模型组比较，稳消方组和辛伐他汀组主动脉内膜相对光滑完整，未见明显增生，仅可见少量斑块。详见图1。

图1 各组腹主动脉组织形态比较(HE，×100)

2.2 免疫组化检测腹主动脉IκBα和NF-κB蛋白表达 IκBα和NF-κB的表达主要位于斑块中，模型组与空白组比较，IκBα和NF-κB在斑块中的表达均增加，差异均有统计学意义(P<0.01)。稳消方组、辛伐他汀组与模型组比较，IκBα蛋白表达增加，NF-κB蛋白表达减少，差异均有统计学意义(P<0.01)。详见图2、表1。

图2 免疫组化检测腹主动脉IκBα和NF-κB蛋白表达(IHC，×200)

表1 免疫组法各组腹主动脉IκBα和NF-κB蛋白表达比较(±s)

2.3 Western Bolt法检测腹主动脉IκBα和NF-κB蛋白表达 模型组与空白组比较，IκBα和NF-κB蛋白表达均增加，差异均有统计学意义(P<0.01)。稳消方组与模型组比较，IκBα蛋白表达增加，NF-κB蛋白表达减少，差异均有统计学意义(P<0.01)。辛伐他汀组与模型组比较，IκBα蛋白表达增加，但差异无统计学意义(P>0.05)，NF-κB蛋白表达减少，差异有统计学意义(P<0.01)。详见图3、表2。

A为空白组；B为模型组；C为稳消方组；D为辛伐他汀组。

表2 Western Bolt法各组腹主动脉IκBα和NF-κB蛋白表达比较(±s)

3 讨 论

高脂饲料饲养是最常用的建模方法，兔是草食性动物，对高脂饮食极为敏感，短期内即可完成动脉粥样硬化实验兔的造模，并且动脉粥样硬化模型兔局部动脉的病理特征与人动脉粥样硬化的病理特征相似。药物干预后，进行HE染色，观察各组病理组织形态，空白组可见内膜光滑完整，平滑肌细胞排列整齐，模型组可见主动脉内膜区域发生明显增厚，动脉粥样硬化斑块形成，内见泡沫细胞，平滑肌细胞排列不规则，稳消方组及辛伐他汀组可见少量斑块。与模型组比较，稳消方组及辛伐他汀组斑块较小，对于稳消方是否能够减小斑块的大小，在后续的实验中需要进一步研究。但从HE染色的结果看，稳消方组和辛伐他汀组的斑块大小明显小于模型组。

炎症反应贯穿动脉粥样硬化的全过程，转录因子NF-κB是炎症、免疫应答和细胞存活的关键调节因子之一。IκB是NF-κB的调控抑制剂，在静息状态下，NF-κB二聚体与IκB蛋白复合物存在于细胞质中。NF-κB激活主要通过IκBα的降解实现，IκB激酶(IKK)是NF-κB活化的关键调节激酶[19]，NF-κB活化的关键步骤是IKK复合物对IκB蛋白的磷酸化[20]。由于受到炎症信号刺激，IκB蛋白在IκB激酶的作用下发生磷酸化，使蛋白酶体发生降解，NF-κB转移到细胞核，在κB位点上与基因启动子中的元件特异性结合，诱导促炎性因子的表达。研究发现在动脉粥样硬化斑块内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞中检测到活化的NF-κB[21]。本实验通过免疫组化法检测发现，IκBα和NF-κB的表达主要位于斑块中，模型组与空白组比较，IκBα和NF-κB在斑块中的表达均明显增加。稳消方组与模型组比较，IκBα蛋白表达明显增加，NF-κB蛋白表达明显减少。

IκB是NF-κB的负反馈调节剂，许多参与致动脉粥样硬化事件的促炎性因子的表达直接受NF-κB调控，研究表明IκBα的过表达可有效抑制NF-κB的激活从而减少内膜增生和平滑肌细胞增殖，抑制动脉粥样硬化斑块细胞释放细胞因子[22-23]，研究发现在IκBα缺乏的小鼠血管壁中出现巨噬细胞聚集增加的现象[24]。IκB的基因转移可能潜在地抑制NF-κB途径，IκB蛋白通过阻断NF-κB的激活，可以抑制白细胞介素(IL)-6炎症介质的表达[25]。Western Bolt检测结果显示，稳消方组与模型组比较，IκBα蛋白表达明显增加，NF-κB蛋白表达明显减少。辛伐他汀组与模型组比较，IκBα蛋白表达未见明显增加，NF-κB蛋白表达明显减少。提示稳消方可能通过增加IκBα蛋白水平，抑制NF-κB活化，抑制炎性因子的过表达，减轻炎症反应，对稳定斑块、抑制动脉粥样硬化具有一定作用。