殷悦涵 孙丽颖 田文

作者单位：100035 北京积水潭医院手外科、北京大学第四临床医学院

PIK3CA 相关的过度生长现象 ( PROS ) 是一类疾病的总称，包括多种过度生长性的罕见病，从单个手指到整个肢体，甚至可以包括腹部和脑[1]。该类疾病常为先天性，无家族史，病程呈进展性。其病因为 PIK3CA 基因突变，活化下游的 AKT 及 mTOR 信号通路，促进组织细胞过度生长[2]。目前该病尚无药物治疗，通常需要手术治疗，但术后复发率高，常需多次手术，为患者及其家庭带来很大的负担。雷帕霉素通过与 FKBP12 结合，抑制 mTOR 的功能，从而抑制该通路下游的一系列生理功能，发挥药理作用[3]。此前研究表明雷帕霉素安全性较高[4]，可以应用于小儿，有可能用于 PROS 的药物治疗。现就 PI3K-AKTmTOR 信号通路、PIK3CA 基因突变对该通路的影响、PROS 的发病机制及雷帕霉素的生物学作用及临床应用等综述如下。

一、PI3K-AKT-mTOR 通路

PI3K-AKT-mTOR 通路作为细胞内非常重要的信号转导途径——在细胞的生长、增殖、凋亡、血管生成、自吞噬等过程中发挥着极其重要的生物学功能，该通路紊乱会引起一系列疾病，如癌症、神经病变、自身免疫性疾病和造血系统疾病等[5]。

PI3Ks 信号参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种功能的调节，其活性增加常与多种癌症相关。PI3K的磷脂酰肌醇 PI 的肌醇环上有 5 个可被磷酸化的位点，多种激酶可磷酸化磷脂酰肌醇 ( PI ) 肌醇环上的第四、五位点，可使其一或两者均发生磷酸化修饰[6]。通常 PI-4，5-二磷酸 ( 4，5-二磷酸磷脂酰肌醇，PIP2 ) 在磷脂酶 C 的作用下，产生二酰甘油和 1，4，5-三磷酸肌醇。PI3K 转移一个磷酸基团至位点 3，形成的产物对细胞的功能具有重要的影响，如单磷酸化的 3-磷酸磷脂酰肌醇，能刺激细胞迁移，而未磷酸化的则不能。3，4-二磷酸磷脂酰肌醇则可促进细胞的增殖、抑制细胞凋亡，而其前体分子4-磷酸磷脂酰肌醇则不能[7]。PIP2 转换为 3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇，可调节细胞的黏附、生长和存活。

PI3K 可分为 3 型，其结构与功能各异，I 型的底物主要为 PI、3-磷酸磷脂酰肌醇 ( PIP ) 级 PIP2；II 型的底物主要为 PI 及 PIP；III 型的底物主要为 PI。其中研究最广泛的为 I 型，其为异源二聚体，由一个调节亚基 p85 和一个催化亚基 p110 ( 包括 p110α，β，δ，γ，而 δ 仅存在于白细胞中，其余则广泛分布于各种细胞中 ) 组成[8]。PI3K通过两种方式激活，其一是与具有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体或连接蛋白相互作用，引起二聚体构象改变而被激活；其二是通过 Ras 和 p110 直接结合导致 PI3K 的活化。PI3K 激活的结果是将 PIP2 催化成 3 位磷酸的第二信使 PIP3 ( 3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇 )。PIP3 与细胞内含有 PH 结构域的信号蛋白 AKT 和 PDK1 结合，促使 PDK1磷酸化 AKT 蛋白的 Ser308 导致 AKT 的活化。AKT 则会进一步将信号传递至下游分子，如 mTORC1、GSK3 以及BCL-2 等来调节不同的细胞生理学过程，如细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等 ( 图1、2 )[6,9]。

二、PIK3CA 基因突变对该通路的影响

PIK3CA 基因是属于 PI3K-AKT-mTOR 信号通路中的一个关键原癌基因，位于 3 号染色体上，共有 20 个外显子[10]。PIK3CA 突变约 80% 发生在螺旋区 ( Helical ) 和激酶区 ( Kinase ) 这两个热点区域，其中最常见的三个突变是外显子 20 上的 H1047R，外显子 9 上的 E542K 和 E545K。许多研究证实多种人类实体肿瘤中存在着 PIK3CA 突变。

PIK3CA 基因编码的蛋白质是 IA 型 PI3Ks 的催化亚基，PIK3CA 突变后可导致激酶活性增强，继而持续刺激下游 AKT，增加细胞侵袭和转移能力，与结直肠癌、成胶质细胞瘤、胃癌、乳腺癌和肺癌相关[6,11]。同时，随着过度生长类疾病越来越受到重视，已经有研究发现 PIK3CA基因突变在过度生长类疾病中起着至关重要的作用。

三、PIK3CA 突变与 PROS

PROS 指由 PIK3CA 基因突变引起的罕见的、非对称性的过度生长。PIK3CA 基因编码磷酸酰肌醇-3 激酶( PI3K ) 的 p110α 催化亚基，而 PI3K 能够活化下游的 AKT及 mTOR 信号通路[2]，促进组织生长，引起多样的非对称性过度生长，包括：脂肪组织、肌肉、皮肤、骨、血管、淋巴管、神经组织等[12-15]。最常见的是脂肪组织和血管的过度生长，反映了这些组织具有较强的可塑性和生长潜力。PROS 的并发症取决于其解剖学位置和过度生长的范围，包括：功能障碍 ( 如行走障碍、吞咽困难 )、疼痛、复发性浅表感染、血栓栓塞、出血，上述均影响人的健康，并可导致早期死亡。而现有的治疗主要是缩容术、截肢、血管栓塞，治疗效果并不理想，有较高的术后复发率及再手术率[16]。

已有研究发现一些基因型与表型的对应关系[6,17]，突变发生的时间和位点不同导致表型不同，这是导致 PROS患者间个体差异大的根本原因。此外，也有一些过度生长仅发生于儿童时期，还有一些在成年后逐渐发生，其原因尚不清楚。过度生长的组织与正常组织在影像学上往往缺乏明显的分界，这些都增加了治疗方法研究的难度。

PIK3CA 体细胞突变的表型在不同患者中既有相同点，又有不同点[2]，包括：巨脑及毛细血管畸形 ( megalencephaly-capillary malformation，MCAP / M-CM )[12]，纤维脂肪过度生长 ( fibroadipose hyperplasia or overgrowth，FAO )[13]，不对称性多发性脂肪瘤病 ( hemihyperplasia with multiple lipomatosis ，HHML )[14]，先天性脂肪瘤性过度生长、血管畸形、表皮痣综合征 ( Congenital Lipomatous Overgrowth，Vascular Malformations，and Epidermal，CLOVES syndrome )[11,15,18]，巨指症 ( macrodactyly )，半侧巨脑综合征 ( hemimegalencephaly )[11,15,18]，偏身性肌肥大( macrodactyly and muscle hemihypertrophy )，面部渗透性脂肪增生 ( facial infiltrating lipomatosis )[20]，脂溢性角化病( seborrheic keratoses )[21]，良性苔藓角化病 ( benign lichenoid keratoses )[22]，巨脑综合征 ( megalencephaly syndromes ) 等 ( 图3、4 )[10]。

四、雷帕霉素在该过程中的作用机制

图1 PI3K-AKT-mTOR 信号通路示意图： 促进； 抑制Fig.1 PI3K-AKT-mTOR signal pathway:enhance;inhibit

图2 PI3K-AKT 通路的信号调控。这些因子的作用为调节细胞的生长、增殖、代谢及自噬；BAD：细胞凋亡的 BCL-2 抑制因子；GS：糖原合酶；GSK3：糖原合酶激酶 3；AS160：160kDa的 AKT 底物；FOXO：叉形头转录因子 O 亚型；BIM：与 BCL-2相互作用的细胞凋亡诱导因子；TSC2：结节性硬化症 2；RHEB：脑 RAS 同系物；eIF4E：真核细胞翻译起始因子 4E；4EBP1：eIF4E 结合蛋白 1；rS6：核糖体 S6 蛋白；S6K：S6 激酶；eNOS：上皮一氧化氮合成酶Fig.2 The signal regulation of PI3K-AKT pathway. These cell factors regulates cell growth, proliferation, metabolism and autophagy.BAD: BCL-2 antagonist of cell death; GS: glycogen synthase; GSK3:GS kinase 3; AS160: AKT substrate of 160 kDa; FOXO: forkhead box O; BIM: BCL-2-interacting mediator of cell death; TSC2: tuberous sclerosis 2; RHEB: RAS homologue enriched in brain; eIF4E:eukaryotic translation-initiation factor 4E; 4EBP1: eIF4E-binding protein 1; rS6: ribosomal S6 protein; S6K: S6 kinase; eNOS: epithelial nitric oxide synthase

雷帕霉素通过与 FKBP12 结合，抑制 mTOR 的功能[23]，从而实现其免疫抑制作用 ( 图5 )[3]。FKBP12-雷帕霉素复合物与 mTOR 相互作用，产生的 FKBP12-雷帕霉素-mTOR 复合物干扰 IL-2 受体与其它细胞因子、生长因子受体的通路[24-27]。因此，它抑制 T 细胞细胞周期中 G1期到 S 期的进展，从而抑制 T-细胞增殖 ( 图5 )[28]。

五、雷帕霉素治疗 PROS 的临床试验

雷帕霉素作为 mTOR 抑制剂，被批准应用于移植后的免疫抑制治疗，它还可以减缓携带 PIK3CA 变异的癌细胞的生长[29]。雷帕霉素能够有效地抑制 AKT 信号通路，并抑制 PROS 患者真皮纤维母细胞的增殖[29]，这提示雷帕霉素治疗 PROS 有效。尚有一些未发表的研究提出了雷帕霉素对于 PROS 患者的超适应证应用[30]。为了进一步评估雷帕霉素治疗 PROS 的效果，Parker 等[4]分别在英国、美国、法国的多个中心进行低剂量雷帕霉素治疗 PIK3CA 突变的 PROS 的临床研究，并定量评估疾病进程。

该研究为非随机、开放性研究，前期进行 26 周的观察以测量生长情况 ( 图6 )。研究中，尽可能地对患侧及健侧进行受试者内部比较。由于人们已逐渐认可雷帕霉素在PROS 患者中的超适应证应用[31]，该研究未设置安慰剂对照组。该试验共持续 52 周，第 0～26 周不使用药物，称为预处理期；第 26～52 周使用药物，称为治疗期；受试者在第 0 周 ( 预处理期之前 )、第 26 周 ( 预处理期之后、治疗期之前 )、第 52 周 ( 接受 26 周的治疗之后 ) 进行雷帕霉素有效性的评估。

图3 PI3K-AKT 通路及相关的过度生长疾病Fig.3 PI3K-AKT pathway and related overgrowth syndrome

图4 PIK3CA 不同位点的突变与过度生长临床表型的关系 [10]( *热点突变；**强相关性；+中度相关性 )Fig.4 Different mutations of PIK3CA and related clinical overgrowth syndrome ( *Hot spot mutations; **Strong mutations; +Intermediate )

图5 免疫抑制剂雷帕霉素、他克莫司、环孢素 A 的作用机制 [42]。雷帕霉素通过与其细胞内受体 FK506 结合蛋白 12 ( FKBP12 ) 结合，抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 ( mTOR )。mTOR 分为两个结构不同的催化亚基：mTOR 复合物 1 ( mTORC1 ) 和 mTOR复合物 2 ( mTORC2 )。mTORC1 对雷帕霉素敏感 ( 实线 )，而mTORC2 只有在长期暴露于雷帕霉素时才受其影响 ( 虚线 )。雷帕霉素与 mTORC1 结合，可阻止 T 细胞 G1 期向 S 期的细胞周期进展，从而抑制 T 细胞增殖。而他克莫司和环孢素分别与 FKBP和环卟啉结合，产生的复合物阻断钙调神经素的作用，而钙调神经素是活化的 T 细胞核因子 ( NF-ATc ) 进行脱磷作用所必需的。上述过程导致 NF-ATc 向细胞核运转的过程受到抑制，抑制白细胞介素-2 的基因转录Fig.5 The mechanism of rapamycin, tacrolimus and cyclosporin.Rapamycin inhibits mTOR by binding to FKBP12. There are two different catalytic subunits of mTOR: mTOR complex 1 ( mTORC1 )and mTOR complex 2 ( mTORC2 ). mTORC1 is sensitive to rapamycin ( solid line ) but mTORC2 is only affected when longterm exposure to rapamycin ( dotted line ). Rapamycin bounds to mTORC1 to inhibit the cell cycle from G1 phase to S phase of T cells.While tacrolimus and cyclosporin bound to FKBP and cyclophylin respectively, the production inhibits calcineurin which is required for dephosphrylation of the NF-ATc. The process mentioned above results in the inhibition of NF-ATc transfer to nucleus, and inhibits the transcription of IL-2

儿童及成人的雷帕霉素药代动力学数据参考肾移植所用剂量的计算方法[32]。根据一项体外临床预实验的结果[33]，将雷帕霉素的目标血药浓度定为 2～6 ng / ml，以使不良反应最小[34]。该研究中，所有受试者的平均雷帕霉素血药浓度为 3.4 nm / ml，中位水平为 3.3 ng / ml。成人平均每日总剂量为 1.2 mg 胶囊口服 QD；儿童为 0.58 mg 口服溶液 BID。定期进行实验室检查包括：血细胞计数、肾功能、肝功能、快速血糖、血脂、尿液分析以检测受试者的健康情况 ( 图6a )。

研究人员通过对患侧临床观察及健、患侧对比来评估过度生长的情况。选择无过度生长、无皮肤及血管异常的正常组织作为对照。正常组织与受累部位进行对比，优先顺序为：对侧肢体 / 躯干、同侧肢体 / 躯干、其它无明确受累的部位。非对称性但广泛受累的情况被认为没有正常组织。对每位受试者在第 0、26、52 周进行双能 X 线骨密度 ( DXA ) 扫描。DXA 图像可实现局部和全身的可重复测量，包括骨、脂肪、肌肉，但无法评估血管和淋巴管畸形[21]。对于不能一次完成扫描的成年人 (n＝3 )，进行第二次扫描以涵盖全身。该检查能够获得软组织密度和身体各节段 ( 左腿、右腿、左侧躯干、右侧躯干、左臂、右臂、头 ) 的密度，脂肪为 0.9 g / ml，肌肉组织为 1.1 g / ml[35]。总组织容量包括脂肪组织和肌肉组织，不包括骨。同时，对每位受试者在 0、26、52 周进行 MRI 扫描以进一步评估。扫描区域的范围是病变最近及最远端的骨解剖标志位置，采用斜位平面扫描，扫描厚度为 5 mm，最多 100 片。扫描结果在分析前为盲法。计算体积时使用 SliceOmatic 软件，可将理想的脂肪体积直观地显示出来 ( Dixon 序列 )，通过对不同梯度的计算以进行形态学区分。

图6 该非随机开放性实验的流程图 a：受试者评估入组 / 排除、分配的流程图。在 39 名受试者中，30 名完成 26 周的雷帕霉素治疗，30 名中的 23 名进行了解剖学疗效评估。对所有受试者进行安全性和耐受性的评估；b：整体的研究流程。DXA / MRI =双能射线吸收法 / 核磁共振Fig.6 The flow chart of the nonrandomized open-label study a: The inclusion / exclusion and allocation of the participants. 30 of the 39 enrolled participants completed 26 weeks of sirolimus therapy, and 23 of the 30 received therapeutic effect evaluation by anatomic method.All participants received safety and tolerability evaluation; b: The research procedure. DXA / MRI = dual energy X-ray absorptiometry /magnetic resonance imaging

Parker 等[4]的临床试验筛选 41 名受试者，39 名入组。其中 22 名儿童 ( ＜16 岁，最小者 3 岁 )，17 名成人( ≥ 16 岁，最大者 48 岁 ) ( 图6b )；平均 16.6 岁；44% 为女性，56% 为男性。30 名完成 26 周的用药，2 名在用药23 周后因暂时停药而没有完成试验，7 名因发生不良事件退出试验，退出标准为：不良事件 ( AEs ) 等级 ≥ 3，包括中性粒细胞减少症、蛋白尿 ( 定性检测 3+ )、肝功能异常 ( ALT 高于正常上限 3 倍 )、肾功能异常 ( 肾小球滤过率GFR＜70 mls / min / 1.73 m2)、肺炎或肺功能下降；严重、复发的感染或败血症；QT 间期延长。完成 26 周试验的30 名中，97% 的受试者接受 80% 以上的每日剂量。结果显示，在雷帕霉素治疗期间，受累组织的容积降低 7.2%( -7.2%，SD 16.0；P＝0.04 )，而未受累的组织没有显著增加 ( +1.7%，SD 11.5；P＝0.48 )。肌肉、结缔组织和血管组织显著减少 6.3% ( -6.3%，SD 13.3；P＝0.03 )，脂肪组织减少为 9.8% ( 9.8%，SD 24.4；P＝0.07 )。但这项研究也有一些局限性。尽管突变基因相同，但受试者的表型差异很大；且样本量较小，故在评估雷帕霉素治疗过度生长有效性方面仍需要继续研究。

六、展望

PI3K-AKT-mTOR 通路作为细胞内非常重要的信号转导途径——在细胞的生长、增殖、凋亡、血管生成、自吞噬等过程中发挥着极其重要的生物学功能，PIK3CA 基因编码 PI3K 的催化亚基，而 PI3K 能够活化下游的 AKT 及mTOR 信号通路，促进组织生长，引起多样的非对称性过度生长[36-39]。雷帕霉素作为肾移植的免疫抑制剂已被广泛应用于临床，已有大量研究就其药代动力学、安全性及不良反应进行了阐述[40-41]，是一种较为安全的临床用药，此前曾用于多种疾病的治疗。根据雷帕霉素的作用机制，其在治疗 PROS 时的疗效值得期待。现国外已有相关临床试验初步验证雷帕霉素治疗 PROS 有效[42]，可以进一步开展相关临床试验，验证其有效性及安全性，并细化其在小儿患者中的使用剂量，制订相关用药指南，为 PROS 的药物治疗提供新的思路。