于 睿,高洪莲,李欣蒙,刘奇奇,张 磊

0引言

在过去的30a里，近视的发病率显著增加，预计到2050年，全球将有一半的人口发展为近视[1]。屈光手术有着很大的临床需求，而准分子激光角膜切削术(photorefractive keratectomy，PRK)经过不断地改良和完善，以其安全高效、术后角膜生物力学稳定和无角膜瓣并发症风险等优势目前仍在广泛应用[2-4]。角膜上皮下雾状混浊(haze)是PRK术后最常见的并发症，会引起屈光回退、眩光和对比敏感度下降等问题。目前临床中常用于控制haze的药物包括糖皮质激素、抗代谢药物、非甾体类抗炎药等，上述药物主要通过抗炎与抗凋亡途径来抑制haze，但存在继发激素性高眼压、浅层点状角膜炎和角膜内皮毒性损害等不良反应的可能[5]。haze是由于基质重建过程中胶原纤维生成与降解的失衡，引起胶原纤维排列紊乱导致的，目前有研究表明调节自噬活性可以抑制组织的纤维化程度[6-8]。雷帕霉素(rapamycin)属于大环内酯类抗生素，也是一种自噬激活剂，有研究发现雷帕霉素可以抑制mTOR通路，增强细胞自噬活性，进而抑制肾脏、心肌等组织纤维化程度[9-12]。本研究拟通过建立兔眼PRK手术模型，术后给予雷帕霉素滴眼液治疗，观察其对角膜haze形成的影响，并初步分析自噬因子及相关凋亡基因的表达情况。

1材料和方法

1.1材料实验动物：健康普通级新西兰大白兔80只，雌雄不限，体质量2.0～2.5kg，购于济南西岭角养殖繁育中心，入组前筛查排除无眼部疾病。实验动物的喂养和使用遵循滨州医学院动物管理委员会相关规定。本研究方案经滨州医学院附属医院伦理委员会审批。主要试剂：DMSO(北京索莱宝生物科技有限公司)；雷帕霉素(MedChemExpress公司)；小鼠增强聚合物法检测系统(北京中杉金桥生物科技有限公司)；鼠源性转化生长因子-β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体(英国Abcam公司)；DAB显色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；动物组织总RNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司)；反转录试剂盒，荧光定量PCR试剂盒(美国Roche公司)。主要仪器：准分子激光仪VISX STAR S4(美国AMO公司)；裂隙灯显微镜(瑞士Haag-Streit公司，BQ-900)。

1.2方法

1.2.1兔PRK模型的制作和分组将80只新西兰大白兔采用随机数字表法分为正常对照组、单纯手术组、14μmol/L 二甲基亚砜(DMSO)组、50μmol/L雷帕霉素组和100μmol/L雷帕霉素组,各16只，均取右眼为实验眼。单纯手术组、14μmol/L DMSO组、50μmol/L雷帕霉素组和100μmol/L雷帕霉素组术前3d给予质量分数0.3%氧氟沙星眼膏点眼预防感染，术前耳缘静脉注射质量分数3%戊巴比妥钠(30mg/kg)进行全身麻醉，质量分数0.4%盐酸奥布卡因滴眼液行眼表麻醉，准分子激光系统下行PRK手术；激光参数：准分子激光治疗性角膜切削术(phototherapeutic keratectomy，PTK)模式去除角膜上皮，能量设置160mJ/cm2，切削深度120μm，光学区切削直径6.0mm。术后平衡盐水冲洗，配戴软性角膜接触镜，术后每天3次质量分数0.3%氧氟沙星眼膏涂眼，预防感染。

1.2.2雷帕霉素滴眼液的配制及给药方式DMSO助溶雷帕霉素，配制为100mmol/L的雷帕霉素母液，无菌操作下用生理盐水稀释为50μmol/L和100μmol/L的雷帕霉素滴眼液，DMSO终浓度为0.1%。14μmol/L DMSO组、50μmol/L雷帕霉素组和100μmol/L雷帕霉素组分别应用14μmol/L DMSO、50μmol/L雷帕霉素和100μmol/L雷帕霉素点眼，每天3次，每次1滴，连续给药7d，单纯手术组只行PRK手术，正常对照组不做任何处理。

1.2.3术后角膜上皮愈合时间及haze分级术后每日观察实验眼有无感染发生以及角膜上皮的愈合情况，记录并进行比较。术后1、4wk进行haze分级。采用Fantes的分级标准：角膜透明为0级；裂隙灯下仔细观察可见角膜细微混浊为1级；易观察到轻度混浊为2级；中度混浊，影响观察虹膜结构为3级；重度混浊，遮挡眼内结构为4级[13]。

1.2.4标本采集及石蜡切片制作术后1、4wk各组分别任意选取8只新西兰大白兔，采用空气栓塞法处死，处死后迅速取实验眼角膜，其中4只角膜放入质量分数4%多聚甲醛中固定，经脱水、透明和石蜡包埋后，制成4μm石蜡切片；另外4只放入-80℃冰箱冻存进行PCR。

1.2.5免疫组化检测α-SMA和TGF-β1及MMP-2的表达石蜡切片烤片，脱蜡，高压抗原修复，封闭液封闭30min，一抗分别滴加小鼠抗兔α-SMA(1∶100)、TGF-β1(1∶50)、MMP-2(1∶100)，4℃孵育过夜，滴加反应增强液，滴加增强酶标山羊抗小鼠IgG聚合物，DAB显色(出现棕黄色即为阳性)，苏木素复染1min，经脱水、透明后用中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照。光学显微镜下观察各标本，400倍镜下每张切片任意选取3个视野，通过Image Pro Plus 6.0图像处理分析软件分析各组染色区的吸光度(A)值。

1.2.6RealTimePCR法检测ATG5和ATG12与Bcl-2及Caspase3的mRNA表达水平将角膜置于冰上研磨，用动物组织总RNA提取试剂盒提取总RNA，紫外分光光度计测定提取RNA的浓度；根据NCBI提供的基因序列，由Takara合成引物序列(表1)。用反转录试剂盒进行反转录，合成cDNA；以GAPDH为内参。按2×SYBR Green qPCR Mix说明书设置PCR反应条件，记录CT值，使用2-ΔΔCT法进行分析。

表1 引物序列

2结果

2.1各组兔眼术后角膜上皮愈合时间的比较术后每天用手持裂隙灯观察兔角膜愈合情况，各组角膜上皮均在术后3～4d内愈合。单纯手术组、14μmol/L DMSO组、50μmol/L雷帕霉素组和100μmol/L雷帕霉素组术后角膜上皮愈合时间分别为3.44±0.51、3.50±0.52、3.38±0.50、

3.25±0.45d，各组兔眼术后角膜上皮愈合时间比较，差异无统计学意义(F=0.745，P=0.530)。

2.2各组兔眼术后haze分级比较正常对照组无haze形成。单纯手术组、14μmol/L DMSO组、50μmol/L雷帕霉素组和100μmol/L雷帕霉素组均在术后1wk出现不同程度haze，术后4wk时haze症状最重。术后1、4wk，单纯手术组和14μmol/L DMSO组haze症状均较严重，其次为50μmol/L雷帕霉素组，100μmol/L雷帕霉素组haze症状较其他组明显减轻(图1)。各组不同时间点haze分级的比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，其中50μmol/L雷帕霉素组和100μmol/L雷帕霉素组haze分级较单纯手术组和14μmol/L DMSO组明显降低，100μmol/L雷帕霉素组haze分级较50μmol/L雷帕霉素组明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；单纯手术组和14μmol/L DMSO组haze分级比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

图1 裂隙灯显微镜观察各组兔眼不同时间点haze情况 A：1wk后正常对照组；B：术后1wk单纯手术组；C：术后1wk 14μmol/L DMSO组；D：术后1wk 50μmol/L雷帕霉素组；E：术后1wk 100μmol/L雷帕霉素组；F：4wk后正常对照组；G：术后4wk单纯手术组；H：术后4wk 14μmol/L DMSO组；I：术后4wk 50μmol/L雷帕霉素组；J：术后4wk 100μmol/L雷帕霉素组。

表2 PRK术后不同时间点各组haze分级比较 级)

2.3各组兔角膜TGF-β1和MMP-2及α-SMA的表达正常对照组角膜中表达微量MMP-2，无α-SMA和TGF-β1表达。PRK术后1wk，各组均出现TGF-β1、MMP-2、α-SMA表达，在50、100μmol/L雷帕霉素组中表达呈弱阳性，在单纯手术组和14μmol/L DMSO组中呈中等阳性；PRK术后4wk，各组TGF-β1、MMP-2、α-SMA表达均增强(图2～4)。各组兔眼不同时间点TGF-β1、MMP-2、α-SMA 3种因子平均A值比较，差异均有统计学意义(均P<0.01)，其中术后各时间点50、100μmol/L雷帕霉素组TGF-β1、MMP-2、α-SMA 3种因子平均A值均较单纯手术组和14μmol/L DMSO组明显降低；100μmol/L雷帕霉素组TGF-β1、MMP-2、α-SMA 3种因子平均A值较50μmol/L雷帕霉素组明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；单纯手术组、14μmol/L DMSO组、50μmol/L雷帕霉素组和100μmol/L雷帕霉素组MMP-2因子平均A值较正常对照组升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；单纯手术组和14μmol/L DMSO组TGF-β1、α-SMA 平均A值比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3、4。

表3 各组兔眼术后不同时间点角膜中TGF-β1和α-SMA表达的比较

图2 免疫组织化学法检测角膜中TGF-β1情况(DAB) A：1wk后正常对照组；B：术后1wk单纯手术组；C：术后1wk 14μmol/L DMSO组；D：术后1wk 50μmol/L雷帕霉素组；E：术后1wk 100μmol/L雷帕霉素组；F：4wk后正常对照组；G：术后4wk单纯手术组；H：术后4wk 14μmol/L DMSO组；I：术后4wk 50μmol/L雷帕霉素组；J：术后4wk 100μmol/L雷帕霉素组。

图3 免疫组织化学法检测角膜中MMP-2情况(DAB) A：1wk后正常对照组；B：术后1wk单纯手术组；C：术后1wk 14μmol/L DMSO组；D：术后1wk 50μmol/L雷帕霉素组；E：术后1wk 100μmol/L雷帕霉素组；F：4wk后正常对照组；G：术后4wk单纯手术组；H：术后4wk 14μmol/L DMSO组；I：术后4wk 50μmol/L雷帕霉素组；J：术后4wk 100μmol/L雷帕霉素组。

2.4RT-PCR检测结果各组不同时间点ATG5、ATG12、Bcl-2和Caspase3 mRNA相对表达量的比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，其中单纯手术组、14μmol/L DMSO组、50μmol/L雷帕霉素组和100μmol/L雷帕霉素组ATG5、ATG12、Caspase3 mRNA相对表达量较正常对照组升高，Bcl-2 mRNA相对表达量较正常对照组降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；50μmol/L雷帕霉素组和100μmol/L雷帕霉素组ATG5、ATG12、Bcl-2 mRNA相对表达量较单纯手术组和14μmol/L DMSO组明显升高，Caspase3 mRNA相对表达量较单纯手术组和14μmol/L DMSO组明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；100μmol/L雷帕霉素组ATG5、ATG12、Bcl-2 mRNA相对表达量较50μmol/L雷帕霉素组明显升高，Caspase3 mRNA相对表达量较50μmol/L雷帕霉素组明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；单纯手术组和14μmol/L DMSO组ATG5、ATG12、Bcl-2和Caspase3 mRNA相对表达量比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表5。

表5 各组不同时间点ATG5、ATG12、Bcl-2、Caspase3 mRNA相对表达量

图4 免疫组织化学法检测角膜中α-SMA情况(DAB) A：1wk后正常对照组；B：术后1wk单纯手术组；C：术后1wk 14μmol/L DMSO组；D：术后1wk 50μmol/L雷帕霉素组；E：术后1wk 100μmol/L雷帕霉素组；F：4wk后正常对照组；G：术后4wk单纯手术组；H：术后4wk 14μmol/L DMSO组；I：术后4wk 50μmol/L雷帕霉素组；J：术后4wk 100μmol/L雷帕霉素组。

表4 各组兔眼术后不同时间点角膜中MMP-2表达的比较

3讨论

PRK后haze形成的过程就是一个角膜创伤过度愈合的过程，这一过程开始于角膜坏死细胞的清除[14-15]。基质损伤后，细胞因子的释放诱导角膜基质细胞发生凋亡，并刺激邻近细胞增殖和迁移[16]。角膜基质细胞在TGF-β1等因子作用下转化为角膜成纤维细胞，分化为角膜肌成纤维细胞，TGF-β1是调控分化的关键因子。肌成纤维细胞可特征性地表达α-SMA，导致胶原纤维排列紊乱。MMPs是Ⅳ型胶原蛋白水解酶，能降解基质中的主要骨架。重建基质过程中产生的细胞外基质(ECM)可以促进肌成纤维细胞的生成，产生粗大胶原纤维，这种降解与生成的失衡导致胶原纤维排列紊乱，从而形成了haze[4,17]。Milani等[18]研究表明应用雷帕霉素后可以抑制α-SMA和TGF-β1的表达；在本研究中发现，PRK术后每日裂隙灯显微镜下观察50μmol/L雷帕霉素组和100μmol/L雷帕霉素组haze严重程度较其他手术组明显减轻，术后1、4wk TGF-β1、MMP-2、α-SMA的表达与各组haze严重程度相同，说明术后应用雷帕霉素可以减轻TGF-β1、MMP-2、α-SMA的表达，抑制haze的形成。

自噬(autophagy)是一种通过溶酶体对细胞质蛋白和细胞器进行精心安排、自我调节的细胞内降解机制，既往许多研究表明自噬对细胞的正常稳态和健康功能至关重要[19]。自噬是由两大类信号分子调控，包括mTOR依赖通路和非mTOR依赖通路，其中前者是主要通路。mTOR是高度保守的Ser/Thr蛋白激酶复合物，调控细胞生长、存活和代谢。此外，mTOR可以促进蛋白质合成[20]，抑制蛋白质分解代谢，并通过调节自噬和凋亡水平[21]来促进细胞生长发育过程。参与自噬的基因被称为自噬相关基因(ATGs)，目前已鉴定出12个ATGs，ATGs的表达水平可以反映自噬的活性,并通过ATG12～ATG5和ATG8(LC3)-PE(磷脂酰乙醇胺)系统[22]调控自噬体的形成。雷帕霉素可以与mTOR受体结合，抑制mTOR发挥作用，是一种典型的mTOR通路抑制剂，也是自噬激活剂。Lin等[23]研究表明应用雷帕霉素后可以通过诱导自噬去降低纤维化水平；在本研究中发现，50μmol/L雷帕霉素组和100μmol/L雷帕霉素组的ATG5和ATG12 mRNA相对表达量较单纯手术组和14μmol/L DMSO组明显上调，提示自噬增强，且角膜纤维化程度较单纯手术组和14μmol/L DMSO组明显减轻。细胞凋亡是程序性的细胞死亡，是消除功能失调或受损细胞的生理过程[24]。Caspase家族是调节细胞凋亡的关键因子，它的级联激活诱导细胞凋亡，而Bcl-2调控Caspase的激活。Lin等[23]研究表明应用雷帕霉素后可以降低细胞凋亡水平；在本研究中发现，50、100μmol/L雷帕霉素组的Bcl-2 mRNA的相对表达量较单纯手术组和14μmol/L DMSO组明显上调，Caspase3 mRNA的相对表达量较单纯手术组和14μmol/L DMSO组明显下调，提示凋亡水平受到抑制，且角膜纤维化程度较单纯手术组和14μmol/L DMSO组明显减轻。在本研究结果中发现100μmol/L雷帕霉素组自噬活性高于50μmol/L雷帕霉素组，且对haze的抑制程度最强，提示雷帕霉素对PRK术后haze的抑制程度可能存在浓度依赖性。

正常情况下角膜组织中的细胞自噬和凋亡水平处于动态平衡的状态，当受到创伤或感染时，不同信号调节通路可能通过激活或抑制自噬来维持细胞内环境的稳定[25]。本研究结果显示，兔眼PRK术后应用雷帕霉素，自噬水平增加，凋亡水平受到抑制，haze形成也受到抑制，提示雷帕霉素可能通过调节自噬活性来抑制haze的形成。但是，雷帕霉素的给药浓度界限需要进一步的实验进行明确，我们会在接下来的实验中进行进一步研究。