陈莹，贾艳增，时东彦，宋文杰，史雨微(.河北医科大学研究生学院，石家庄 05007；.河北医科大学第二医院检验科，石家庄 050000)

诺卡菌属于需氧放线菌，广泛分布于腐生土壤及水和灰尘中，可造成免疫低下人群感染，其感染病例报道呈上升趋势[1]。随着实验室的诊断技术不断提高，诺卡菌的分离率愈来愈高，但是国内关于诺卡菌的地区分布报道不多，且菌株数量也较少[2-3]。本研究收集2016—2019年河北地区10多家医院分离的诺卡菌菌株，并对其进行统一鉴定，结合临床资料探讨其标本分布特征，以期为诺卡菌的临床诊断提供帮助。

1 材料与方法

1.1菌株分离 收集2016—2019年河北地区10多家医院(河北医科大学第二医院、河北省人民医院、河北省中医院、河北省胸科医院、廊坊市人民医院、沧州市中心医院、沧州市中西医结合医院、哈励逊国际和平医院、邢台市人民医院、遵化市人民医院、华北理工大学附属医院、承德医学院附属医院、保定市传染病医院、秦皇岛市第三医院、张家口市第一医院等)临床分离诺卡菌94株，均为非重复分离株，结合临床症状和影像学检查确定为致病菌[1,4]。94株诺卡菌分离自下呼吸道标本68株(72.3%)、分泌物标本20株(21.3%)、血液标本3株(3.2%)、肺脓肿标本1株(1.1%)、脑脓肿标本1株(1.1%)和脑脊液标本1株(1.1%)。分离菌株根据菌落形态和改良抗酸染色进行初步鉴定，并于-70 ℃保存。菌株分离患者中位年龄60岁，其中，男性52例，女性42例。

1.2主要试剂及仪器 去离子水(天根公司)，研磨小杵、2×Es Taq Master Mix(Dye)(北京康为世纪生物公司)；HX-20恒温金属浴(上海沪实业公司)，HC-2518高速离心机(安徽中科中佳科学仪器公司)，621BR50860 T100 Thermal Cycler、733BR0192 ChemiDoc Imaging System(Bio-Rad公司)，JY600C电泳仪(北京君意东方电泳设备公司)，Nano Drop 2000(超微量)分光光度计(Thermo Scientific公司)，ABI 3730XL DNA测序仪(Applied Biosystems公司)，Vitek MS分枝杆菌/诺卡菌试剂盒、Vitek MS质谱仪(法国生物梅里埃公司)。

1.3菌株DNA提取 取血平板上菌落，用研磨小杵使诺卡菌乳化分散于100 μL去离子水中，100 ℃煮沸10 min，10 625×g离心10 min，取上清液作为模板。用分光光度计评价DNA的纯度和含量，A260 nm/A280 nm>1.8为合格。

1.4基因扩增及测序 参照文献[5-6]合成16S rRNA和secA1基因扩增引物，引物序列见表1，由上海生工公司合成。PCR反应体系为50 μL，包括2×Es Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，DNA 4 μL，ddH2O 17 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35个循环；72 ℃ 7 min。产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察。PCR反应产物经纯化送上海生工公司采用3730XL DNA测序仪进行Sanger双向测序。序列与NCBI的基因库进行BLAST比对，根据CLSI MM18-A[7]，若16S rRNA序列与模式菌相似度≥99.0%，且与其他种相似度之差大于0.8%，鉴定为种；若相似度<99.0%或相似度≥99.0%且与其他种相似度之差小于0.8%，则进行secA1序列分析与模式菌相似性达到≥99.0%鉴定到种。

表1 16S rRNA及secA1基因PCR扩增引物及产物大小

1.5基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定 取一环待测菌加入含0.5 mm玻璃珠和500 μL 70%乙醇的1.5 mL离心管中，震荡5 min，室温放置10 min，将菌悬液转入2 mL离心管中，10 625×g离心2 min，弃上清液，向沉淀中加入10 μL 70%甲酸并室温放置5 min，加入10 μL乙腈混匀，10 625×g离心2 min，取1 μL上清液涂于靶板，待干燥加入1 μL基质，干燥后进行MS分析。校准菌株：大肠埃希菌ATCC 8739。鉴定值99.9%则鉴定到种；无鉴定结果或鉴定值小于99.9%，则无法鉴定到种。

2 结果

2.1诺卡菌菌株鉴定结果 94株诺卡菌经基因测序全部鉴定到种，80株(85.1%)经MALDI-TOF MS成功鉴定到种，见表2。MALDI-TOF MS未鉴定到种的包括3株脓肿诺卡菌(无鉴定值)、4株亚洲诺卡菌(无鉴定值)、2株脓液诺卡菌(无鉴定值)、2株华莱士诺卡菌(无鉴定值)、1株新诺卡菌(50%鉴定值)、1株北京诺卡菌(无鉴定值)和1株南非诺卡菌(无鉴定值)。

2.2不同部位诺卡菌的分离情况 68份下呼吸道标本分离菌种分别为圣乔治教堂诺卡菌33株(48.5%)、皮疽诺卡菌11株(16.2%)、豚鼠耳炎诺卡菌8株(11.8%)、脓肿诺卡菌4株(5.9%)、亚洲诺卡菌4株(5.9%)、巴西诺卡菌2株(2.9%)、华莱士诺卡菌2株(2.9%)、脓液诺卡菌1株(1.5%)、南非诺卡菌1株(1.5%)、北京诺卡菌1株(1.5%)和新诺卡菌1株(1.5%)。20份分泌物标本分离菌种分别为巴西诺卡菌5株(25.0%)、皮疽诺卡菌5株(25.0%)、圣乔治教堂诺卡菌4株(20.0%)、脓肿诺卡菌3株(15.0%)、豚鼠耳炎诺卡菌2株(10.0%)和脓液诺卡菌1株(5.0%)。3份血液标本分离菌种分别为皮疽诺卡菌2株(66.7%)和圣乔治教堂诺卡菌1株(33.3%)。肺脓肿标本、脑脓肿标本和脑脊液标本分离菌种均为皮疽诺卡菌。

3 讨论

诺卡菌生长缓慢，生化反应不活泼，其菌种鉴定效果不佳。质谱技术可解决部分诺卡菌的鉴定，但在某些种的鉴定上仍需依靠分子测序技术[8]。本研究94株临床分离诺卡菌经质谱鉴定至种的占85.1%，脓液诺卡菌、亚洲诺卡菌、南非诺卡菌在本研究使用的质谱鉴定系统中缺乏鉴定数据库；而对于脓肿诺卡菌嗜琼脂生长特点，蛋白质提取时可能存在琼脂的干扰而导致质谱图谱分辨率降低；非洲诺卡菌和新诺卡菌属于新诺卡菌群，华莱士诺卡菌和南非诺卡菌属于南非菌群，质谱无法有效区分。94株临床分离诺卡菌采用16S rRNA测序鉴定至种的占97.9%，有2株华莱士诺卡菌补充secA1序列后成功鉴定。16S rRNA基因序列中物种间多态性不够，某些亲缘关系较近物种可能无法进行区分，而对于南非诺卡菌复合群，secA1具有更多的物种间多态性，在识别南非诺卡菌和华莱士诺卡菌中可作为16S rRNA的补充鉴定[6]。

94株临床分离诺卡菌包括11个诺卡菌种。圣乔治教堂诺卡菌分离率最高，其次为皮疽诺卡菌和豚鼠耳炎诺卡菌。美国临床分离率最高菌种为新诺卡菌，其次皮疽诺卡菌和巴西诺卡菌[9]；加拿大最主要流行菌种是新诺卡菌，圣乔治教堂诺卡菌和皮疽诺卡菌较多[10]；澳大利亚主要分离菌种为新诺卡菌、圣乔治教堂诺卡菌、巴西诺卡菌和皮疽诺卡菌[11]；法国最常见分离菌种为皮疽诺卡菌、脓肿诺卡菌、新诺卡菌、圣乔治教堂诺卡菌[12]；而泰国，皮疽诺卡菌、北京诺卡菌和圣乔治教堂诺卡菌是主要分离诺卡菌种[13]。北京朝阳医院圣乔治教堂诺卡菌临床分离率最高，皮疽诺卡菌次之[2]。以上各个文献表明，不同国家菌种分布有所不同，美国和澳大利亚最常见分离菌种为新诺卡菌，而法国和泰国最常见分离菌种为皮疽诺卡菌，而北京朝阳医院和本研究报道以圣乔治教堂诺卡菌最常见。

本研究分离的诺卡菌中以呼吸道标本占比最高，达到72.3 %，其次为分泌物标本(21.3%)。而呼吸道标本分离率最高的是圣乔治教堂诺卡菌，其次为皮疽诺卡菌，第3位为豚鼠耳炎诺卡菌。分泌物标本中分离率最高的是皮疽诺卡菌和巴西诺卡菌，其次为圣乔治教堂诺卡菌。梅奥医学中心分离率最高的部位是呼吸道，其中最常分离新诺卡菌、圣乔治教堂诺卡菌和皮疽诺卡菌[14]。西班牙临床分离菌株中85.9%分离于呼吸道，以圣乔治教堂诺卡菌和新诺卡菌常见[15]。诺卡菌的临床感染部位多数国家以肺部感染常见，皮肤感染次之；不同的标本类型菌种分布也不相同。了解诺卡菌的地区性分布及不同样本来源菌种分布，对临床经验性用药具有指导意义。