杨锐创，胡燕，屈蒙蒙，毕京峰，高鸿雁，柴燕涛，孙慧伟，冯帆，王志杰，邢小燕，侯俊(.解放军总医院第五医学中心临床研究管理中心，北京0009；2.锦州医科大学药学院，辽宁锦州2000；.中国医学科学院药用植物研究所，北京009)

用流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测外周血淋巴细胞亚群已成为临床常见的检查项目。淋巴细胞亚群是监测人体免疫功能的重要指标，对于评价机体的免疫状态、诊断与监测器官移植及免疫病具有重要意义[1-2]。在实验过程中，流式细胞术检测结果可能受多种因素影响。因此，制定规范和标准化的操作流程对提高检测结果的准确性很重要。以往对流式细胞仪检测外周血淋巴细胞亚群影响因素的研究，多在于外周血标本前处理过程中的保存时间、温度、溶血素、刺激剂等[3-8]，而对染色后固定剂及固定时间对检测结果的影响研究较少。样本数量过多时，第一管和最后一管标本检测时间间隔过长，可能影响检测结果，因此需要将染色后的细胞进行固定，以确保检测指标的稳定性。此外，标本数量过少时，频繁开关机会造成浪费，通常选择对标本固定后放置一段时间后统一检测[9-10]。因此，本研究针对健康人群外周血标本，选用临床常用的细胞固定剂多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)[11]，分析细胞染色后不同浓度PFA及固定不同时间对流式细胞仪检测淋巴细胞亚群结果的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 14份外周血标本均来自健康捐献者，其中男、女各7例，年龄26～38岁，平均32岁。采集健康捐献者外周静脉血5 mL，置于乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝管中，颠倒混匀后立即置于样本运送箱中送至实验室，1 h内染色。

1.2仪器与试剂 所有单克隆抗体及鞘液均购自美国BD公司，抗体包括抗CD45-FITC、CD3-APC、CD4-BV421、CD8-PE、CD56-PE-Cy7和CD19-PerCP-Cy5.5抗体。红细胞裂解液为自制NH4Cl裂解液，配制方法为8.3 g NH4Cl、1.0 g KHCO3、0.37 g Na4EDTA溶于800 mL蒸馏水中，以0.2 μm滤膜过滤，调整pH至7.3，用蒸馏水定容到1 000 mL，4 ℃保存待用。FACS Canto Ⅱ流式细胞仪、EDTA-K2抗凝管购自美国BD公司。PFA购自Sigma公司，1% PFA(10 g/L)和4% PFA(40 g/L)用0.1 mol/L磷酸钠缓冲液(PBS，pH7.4)配制，4 ℃保存。

1.3方法 实验分为1% PFA组、4% PFA组、PBS对照组。取EDTA-K2抗凝血100 μL加入Falcon管中，加入5 μL抗CD45-FITC、CD3-APC、CD4-BV421、CD8-PE、CD56-PE-Cy7和CD19-PerCP-Cy5.5抗体，同时设置阴性对照，室温避光20 min。加入2 mL红细胞裂解液，振荡混匀，室温避光5 min，待红细胞完全溶解后，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，再加2 mL PBS洗涤2次，弃上清液，最后加入500 μL 1% PFA或4% PFA固定细胞，对照组加入PBS，于4 ℃避光保存于0、4、8、12、24、48和72 h后上机检测。利用前向角散射光(FSC)与侧向角散射光(SSC)设门圈出淋巴细胞，再以CD45+设门圈出CD45+淋巴细胞，再以CD3、CD19设门圈出CD19-CD3+(T细胞)、CD3-CD19+(B细胞)，以CD3、CD4设门圈出CD3+CD4+(辅助/诱导细胞)，以CD3、CD8设门圈出CD3+CD8+(抑制/细胞毒细胞)，以CD3、CD56设门圈出CD3-CD56+(NK细胞)。BD FACSDiva软件获取数据，收集10 000～20 000个细胞，Flowjo10.0软件分析数据，计算不同固定时间(0、4、8、12、24、48和72 h)后CD19-CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD3-CD19+B、CD3-CD56+NK细胞占淋巴细胞百分比，及CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD56的平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)。

2 结果

2.1PFA浓度对淋巴细胞亚群百分比的影响 流式数据的圈门策略和典型图见图1，细胞分群清晰，数据可用于后续分析。PFA浓度对淋巴细胞亚群百分比的影响见图2。固定8 h后，PBS组出现细胞大量死亡，所以固定8 h后各时间点无PBS对照组结果。与PBS对照组相比，PFA固定0、4、8 h后CD19-CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD3-CD19+B、CD3-CD56+NK细胞占淋巴细胞百分比差异均无统计学意义(P均>0.05)；与1% PFA组相比，4% PFA组固定不同时间后淋巴细胞亚群百分比差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.2PFA固定时间对淋巴细胞亚群百分比的影响 见图3。无论1% PFA或4% PFA，在0～72 h内，固定不同时间CD19-CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD3-CD19+B、CD3-CD56+NK细胞占淋巴细胞百分比与PBS组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

图1 流式细胞术检测人外周血淋巴细胞亚群的圈门策略和典型图

注：A～G，分别固定0、4、8、12、24、48、72 h。

注：A～E，分别为T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、B细胞。

2.3PFA浓度对淋巴细胞亚群MFI的影响 见图4。0 h时检测结果显示，4% PFA组CD3、CD8的MFI低于PBS对照组(P<0.05)，CD45、CD4的MFI低于PBS对照组(P<0.01)；4% PFA组CD3、CD4、CD19的MFI低于1% PFA组(P<0.05)，CD45、CD8、CD56的MFI低于1% PFA组(P<0.01)。

固定4 h后，1% PFA组CD4的MFI低于PBS对照组(P<0.05)，4% PFA组CD3的MFI低于PBS对照组(P<0.05)，4% PFA组CD45、CD4、CD8的MFI低于PBS对照组(P<0.01)；与1% PFA组相比，4% PFA组CD3、CD19的MFI低于1% PFA组(P<0.05)，CD45、CD4、CD8、CD56低于1% PFA组(P<0.01)。

固定8 h后，1% PFA组CD4的MFI低于PBS对照组(P<0.01)，4% PFA组CD19的MFI低于PBS对照组(P<0.05)，4% PFA组CD45、CD3、CD4、CD8的MFI低于PBS对照组(P<0.01)；与1% PFA组相比，4% PFA组CD3、CD8、CD19和CD56的MFI低于1% PFA组(P<0.05)，CD45、CD4的MFI低于1% PFA组(P<0.01)。

固定12 h和24 h后，4% PFA组CD3、CD19、CD56的MFI低于1% PFA组(P<0.05)，CD45、CD4、CD8的MFI低于1% PFA组(P<0.01)。固定48 h后，4% PFA组CD3的MFI低于1% PFA组(P<0.05)，CD45、CD4、CD8、CD56的MFI低于1% PFA组(P<0.01)。固定72 h后，4% PFA组CD3的MFI低于1% PFA组(P<0.05)，CD45、CD4、CD8的MFI低于1% PFA组(P<0.01)。

以上结果提示，PFA浓度对淋巴细胞亚群MFI有影响，PFA固定后MFI下降。固定8 h内，PBS对MFI结果无影响，1% PFA组CD4的MFI下降，4% PFA组CD45、CD3、CD4、CD8的MFI均下降。在72 h的各个观察时间点内，4% PFA组各淋巴细胞亚群的MFI均低于1% PFA组。

注：A～G，分别固定0、4、8、12、24、48、72 h;*，P<0.05；**，P<0.01。

2.4PFA固定时间对淋巴细胞亚群MFI的影响 见图5。固定24 h后的各个时间点，1% PFA组与4% PFA组CD3、CD4、CD8、CD19、CD56和CD45的MFI均下降；尤其CD4的MFI变化较大，1% PFA固定24 h后降低，而4% PFA组在固定4 h后即出现下降趋势。

注：A～F，抗体分别为CD3-APC、CD4-BV421、CD8-PE、CD19-perCP-Cy5.5、CD56-PE-Cy7、CD45-FITC。

3 讨论

临床上常用流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群，以评估患者机体的免疫状态。为避免染色后放置时间过长而导致细胞破碎和抗体荧光淬灭，实际操作中常使用细胞固定剂固定后再上机检测。目前，细胞样本常用的交联剂为PFA，其固定细胞标本不仅可以使检测结果接近细胞表面抗原的真实分布，同时也能延长标本的保存时间。但由于PFA穿透力强，随着甲醛交联蛋白的增加，蛋白质苯环结构上的抗原决定簇的改变有可能降低抗原的敏感性。冯霞等[12]用PFA固定处理人外周血白细胞，流式细胞术检测时发现白细胞表面的P-gp糖蛋白表达降低。孙栋栋等[13]用流式细胞术检测HepG2细胞表面整合素αVβ3，2% PFA固定处理后MFI和阳性细胞率均降低，提示PFA固定可能影响细胞表面抗原抗体的结合。刘云等[14]以小鼠脾淋巴细胞为研究对象，分析2% PFA固定时间对流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞CD3+及CD4+细胞亚群的百分比与MFI的影响，结果发现2% PFA固定24 h后，CD3+、CD4+细胞的MFI降低，但细胞百分比没有明显变化；提示PFA固定时间对抗原表达较强的MFI的影响比其细胞百分比的影响更大。因此，PFA固定浓度、固定时间对抗原结构有无影响尚待进一步研究。

本研究通过对比1%和4%浓度PFA，从0～72 h固定不同时间，FCM检测外周血标本的淋巴细胞亚群百分比及MFI，结果提示在72 h内，PFA浓度及固定时间对外周血淋巴细胞亚群百分比结果没有明显影响，该发现与文献[14]报道一致，进一步证实了对与表达较强的抗原，PFA固定后对抗原表达阳性的细胞百分比影响不大。但PFA固定浓度对淋巴细胞亚群MFI有明显影响，4% PFA固定后淋巴细胞亚群的MFI低于1% PFA固定的样本，且随着固定时间的延长进一步降低。本研究结果提示1% PFA对外周血淋巴细胞CD3、CD4、CD8阳性细胞百分比及MFI的影响较小。

综上所述，流式细胞术检测人外周血淋巴细胞亚群，8 h内检测用PBS进行细胞重悬检测效果最好。细胞染色后若不能立即上机检测，可用1% PFA固定后4 ℃避光保存，建议存放时间不超过12 h。