细胞外基质因子诱导血管化组织工程膜修复半月板损伤研究

2020-11-29杨业静李兴艳李林梁红锁黄家志杨丹凌杜勇军

智慧健康 2020年29期

杨业静，李兴艳，李林，梁红锁，黄家志，杨丹凌，杜勇军⋆

（1.广西医科大学第三临床医学院，广西南宁 530031；2.广西医科大学公共卫生学院，广西南宁 530000）

0 前言

半月板是位于股骨内侧和膝胫骨平台之间的两个纤维软骨组织，由纤维软骨组成，内外各有一块。半月板主要起到稳定关节、增加关节的吻合度等作用，是膝关节运动必不可少的一部分。随着社会人口老龄化的步入、人民生活水平的提高及人民不良生活饮食习惯的突出，肥胖导致的膝关节半月板损伤是骨科常见疾病。半月板损伤的处理，临床上治疗常规是在关节镜下予以部分切除修复或半月板缝合，严重者则予以半月板全部切除，早期治疗效果比较满意，可在一定程度上减轻患者的膝关节局部疼痛、肿胀，但长期则可能产生关节僵硬、肌肉萎缩、失用性萎缩及膝关节退行性改变等疾病，甚至导致软骨及软骨下骨坏死骨关节炎的发生，给患者带来了极大的痛苦及生活压力及大幅度降低了患者的生活质量[1]。因此，从一定程度上讲，膝关节半月板损伤的处理仍然是骨科疾病中研究的一大难题[2]。同时，随着异体组织移植的兴起，异体或异种半月板移植成为修复半月板损伤可能，但供体组织货源少及组织排异等现象出现了较多的移植术后并发症。此外，目前的外科治疗还不能有效的解决半月板损伤后修复的问题。近年来，随着组织工程及干细胞转化再生的广泛引用，干细胞联合组织工程构建人工半月板组织移植成为修复半月板损伤的研究热点[3]。

对于人工半月板组织原材料的研究，较多的是使用胚胎干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、小肠黏膜下层和内皮细胞等作为种子细胞定向分化的研究[4]。众所周知，滑膜间充质干细胞（synovium-derived stem cells，SDSCs）是指来自于膝关节滑膜的间充质干细胞。此外，目前尚未有关于将SDSCs 作为种子细胞构建完整半月板组织的相关报道。结合本实验室之前的研究结果及大量的前人研究报道。目前已经证实SDSCs 能通过体外诱导体系从而生成较成熟且均质的软骨样组织。然而，SDSCs 的体外软骨样组织诱导体系能否在体外成功构建出类似原生态且体积较大的人工半月板形软骨样组织有待学者们的深入研究。

在我们的实验研究中，首先，我们应用兔SDSCs和兔颈静脉血管内皮细胞为本次实验的人工种子细胞，同时联合小肠黏膜下层支架材料，拟在体外构建完整的具有一定力学强度且成熟软骨组织形态的人工组织工程化半月板。并将其植入半月板损伤区。随后，在本实验中，我们对所有新西兰大白兔进行单独饲养，并分别于第4、8、12、16 周时采用人工化、理性化方式处死大白兔后取出新形成的人工半月板。最后，我们采用阿尔新蓝比色法检测糖胺多糖（GAG）含量，同时观察其组织大体形态及生物力学及作为评估指标了解半月板损伤修复情况。进而深入探讨细胞外基质因子诱导血管化组织工程膜修复兔膝关节半月板损伤的潜能及可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 SDSCs 的获取及分离培养

首先，在无菌条件下获取健康新西兰大白兔膝关节滑膜组织后，将其加入10mL 的DMEM 培养基的100mm 培养皿中（培养皿中含2mg/mL II 型胶原酶及20%FBS），随后于5%C02培养箱中消化过夜(约14小时)。同时，过滤提取原代细胞，继而接种到25 mL 塑料培养瓶内放入培养箱常规培养。经3d 半量换液、5d 全量换液后每3 天换液一次，细胞长满培养瓶底面积后予以消化、传代，在倒置显微镜下观察。以第3 代SDSCs 作为种子细胞待用。新西兰大白兔来自广西医科大学动物实验室中心，胎牛血清购自美国Gibco 公司。

1.1.2 血管内皮细胞的获取及分离培养

首先，我们在无菌条件下获取来自健康新西兰大白兔的颈静脉血管组织，并将注射器的灌注针头穿入静脉一端，用PBS 向静脉腔内反复注射冲洗已获得的颈静脉血管组织，继而将静脉内的残留成分冲洗干净。随后，我们取下注射器并抽吸一管空气，目的是将空气注人静脉腔内从而使管腔内的PBS 全部排出。接着，我们再用注射器抽吸一管0.259 毛膜蛋白酶液，将其缓慢推注至静脉腔中，待另一端有少量酶液流出时，迅速结扎有酶液流出的静脉端，继续向静脉腔内注入膜蛋白酶液，直到静脉管壁微微充盈鼓起，结扎灌注针头端的静脉。最后，我们将两端结扎的静脉置人一盛有PBS 的培养皿中，放入37 ℃、5%C02的陪养箱中孵育25 分钟，继而剪断静脉两侧的结扎线，放出消化液，并用另一带灌注针头的注射器注人含20%胎牛血清的 M199 培养液，边冲洗边中止消化。最后，实验人员收集消化液，并置于离心机中离心 5 min；弃上清液，用20%M199 培养液将沉淀的细胞制成悬液，以1.5×105个/mL 接种于培养板中；继而置于37℃、5%C02培养箱中进行培养，12 h 后进行首次换液，以后隔日换液，倒置显微镜下每日进行细胞形态学观察，作为种子细胞备用。

1.1.3 人工半月板组织的构建

首先，我们选取猪空肠脱细胞的SIS 材料作为实验使用的支架(新鲜的猪空肠组织从市场购买，具体的分离提取方法见文献)[5]，并将血管内皮细胞和异体兔SDSCs 作为种子细胞种植在已获得的载体材料上，随后在三维条件不同培养基下联合培养3周，构建血管化组织工程半月板膜，并将组织工程半月板膜多层折叠、修剪整齐至长宽分别约0.4 cm、0.2 cm大小的半月板组织，待以备用。本实验研究以广西医科大学实验室提供的20 只新西兰大白兔为动物模型，体重约为2.0-2.4 kg；新西兰大白兔包括9 只雄性和11 只雌性。

1.2 方法

本实验共选取上述的20 只健康的新西兰白兔作为实验动物。将其固定在手术台上，并在耳静脉进行静脉全麻(2%戊巴比妥钠，约2mg/kg)。常规消毒及铺巾后，以膝关节内侧及外侧弧形切口为手术入路，双侧膝关节同时手术。首先，沿着髌骨上缘到胫骨结节内侧进行约0.8 厘米长的皮肤切口。仔细操作，皮肤、皮下组织和筋膜依次分层切割，以防止对膝关节表面软骨的损伤。随后，内侧半月板前后角、体部和股髁软骨表面完全暴露，半月板被挑起，整个半月板损伤模型是在内侧半月板的前角用镰刀刀片制作的，损伤处稍微靠近内侧半月板的中心。整个操作过程谨慎操作，以防止损伤半月板下软骨。同时，双膝关节外侧半月板造模操作步骤如同内侧半月板损伤造模。完成新西兰大白兔双膝关节内外侧半月板损伤造模（80 个半月板）时将其（左外、左内、右内、右外）随机分为4 组（A 组、B 组、C 组、D 组，20 只健康体质新西兰大白兔膝关节半月板四组之间的分组差异无统计学意义）。A 组植入血管化培养后的人工半月板组织，整齐对合，然后用5-0的可吸收缝线缝合固定；B 组植入未血管化培养的滑膜间充质干细胞-内皮细胞-小肠黏膜下层复合材料，C 组仅植入小肠黏膜下层支架材料，D 组则为自发修复空白对照。随后逐层缝合皮下组织、皮肤。所有新西兰大白兔均予单笼饲养。后分别于术后4周、8 周、12 周、16 周处死大白兔并取材（每次5 只，每只均包括A、B、C、D 四组半月板，共20 个半月板），取材时采用大体形态学观察，并取同等大小的再生组织后采用生物力学测定不同组别弹性模量及采用阿尔新蓝比色法检测糖胺多糖（GAG）平均含量作为评估指标评价半月板损伤修复情况，见图1。

图1 兔膝关节囊显露半月板取材

1.3 观察指标

①半月板取材后采用大体形态学观察时，A 组应注意观察人工半月板植入物的颜色、大小、质地，同时观察其与正常半月板的衔接是否完整，并仔细观察植入的人工半月板与周围正常半月板的差异如光滑度等差异；B 组和C 组应注意观察是否萎缩、是否有再生组织，若有，则观察再生组织的颜色、大小、质地，并与正常半月板的差异；D 组应注意观察半月板造模缺损处是否增大，是否有再生组织，若有，则观察再生组织是否向中心靠拢，并观察其与周围正常半月板组织的差异。此外，还要注意观察与之接触的周围韧带和软骨的变化，是否有韧带损伤即周围软骨软化等情况。在做大体观察形态学比较时，比较同一时期取材的不同组再生组织的形态学变化，同时比较同组再生组织不同取材时期的形态学变化。②切取修复再生组织标本作弹性模量测定时，比较同体异组半月板弹性模量平均值的变化，同时比较同组异体半月板不同时候的弹性模量平均值的变化。③采用阿尔新蓝比色法检测再生半月板组织糖胺多糖（GAG）含量以评估半月板损伤修复情况，见图2。

图2 半月板组织大体形态学观察

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0 统计软件对所有数据进行分析，数据用（平均值±标准差）表示，计量资料数据用t检验进行检验。用卡方检验对计数资料数据进行分析，检验水平a=0.05，P＜0.05 表明差异有统计学意义。

2 结果

所有实验动物新西兰大白兔均存活良好，此次观察指标一共是80 个半月板组织，但有一只新西兰大白兔右膝部外侧伤口发生感染，有一只新西兰大白兔左膝关节活动较差，发生挛缩，因此，这两只新西兰大白兔的所有半月板组织则不纳入观察对象。其他新西兰大白兔的伤口均愈合佳，膝关节活动可。所以，在本实验中，最终观察的半月板一共为72 个（A、B、C、D 四组均为18 个）。我们采用了大体形态学观察，并取同等大小的再生组织后采用阿尔新蓝比色法检测GAG 平均含量及采用生物力学测定不同组别弹性模量平均值作为评估指标评价半月板损伤修复情况。其结果如下。

2.1 大体形态学观察

（1）A 组：术后4 周示人工半月板组织与周围正常半月板衔接良好，周围空隙逐渐愈合，植入的人工半月板组织质地较前稍韧；术后 8 周示人工半月板组织与周围正常半月板边界较模糊，周围空隙进一步变小，空隙处逐渐被白色新生组织充填，愈合良好，质地较韧；术后12 周示周围空隙缺损处已完全被白色半月板样组织所替代，但表面较粗糙，仍较易与周围正常半月板组织辨别；术后16 周示人工半月板与周围正常半月板组织衔接处的再生组织表面光滑，几乎没有差别，难以分辨。（2）B 组：术后4 周示人工半月板组织与周围正常半月板衔接缺损处有部分组织充填，表面柔软，但其体积较小，仍留有较大空隙；术后8 周示缺损修复区缩小，缺损区大部分已被纤维性组织所替代，表面不光滑；术后12 周示缺损处可见白色纤维疤痕样组织，并可见横行或纵行缺损；术后16 周示缺损处已完全被再生组织替代，但表面无A 组16 周时光滑。（3）C 组：术后4 周示缺损处可见部分组织充填，柔软，小肠黏膜下层支架存在，但其体积较前明显缩小；术后8周缺损修复区小肠黏膜下层支架材料均完全消失，缺损区大部分已被纤维性组织所替代；术后12 周可见白色纤维疤痕样组织，并可见横行或纵行缺损。（4）D 组：术后4 周示缺损清晰可见，未见明显新生组织生成；术后8 周示缺损处明显，底部形成少量白色膜状组织；术后12 周，缺损明显，无明显修复迹象，缺损底部有少量纤维组织形成，界限明显；术后16 周示正常半月板中心萎缩，空隙缺损处较前变大。

2.2 弹性模量测定

生物力学弹性模量测定结果显示4 组半月板组织的弹性模量随时间而逐渐增加，A 组半月板4 周、8 周、12 周、16 周的弹性模量分别是：（39.26±1.74）Mpa、（71.09±2.18）Mpa、（99.38±1.98）Mpa、（105.64±3.41）Mpa；A 组标本4 个时间点弹性模量平均值间比较和与其他三组弹性模量平均值之间的比较具有统计学差异，如表1。

表1 半月板弹性模量的测定 (Mpa，)

2.3 GAG 含量测定

阿尔新蓝比色法检测再生半月板组织糖胺多糖（GAG）含量结果显示4 组半月板GAG 含量均随着时间的增加而增高；在同一时期不同组GAG 含量的差异性比较具有统计学意义；如表2。

表2 兔半月板GAG 含量的测定(ug/mL，)

3 讨论

膝关节半月板是膝关节结构的重要组件，对减缓重力对胫骨平台的压迫及促进膝关节屈伸活动具有重要作用。同时，半月板因其血运差等解剖特点而损伤后难以愈合[6]。因此，对于膝关节半月板的损伤，应尽量予以修复以防止后期膝关节骨性关节炎的发生。目前对于半月板损伤的治疗，主要在于外科手术对其进行手术修缝合或部分切除，而术后引发的膝关节骨性关节炎严重影响了患者的生活质量[7]。

随着干细胞分化机制及组织移植组织工程研究的兴起，已有部分研究将膝关节半月板损伤的治疗朝向干细胞分化软骨细胞及软骨组织移植上；如张庆金等人为研究骨关节炎的治疗方式时发现骨髓间充质干细胞可定向分化为软骨细胞[8]；亦如脂肪干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞的软骨分化等[9-11]。这些学者们将干细胞转分化为软骨细胞后，联合细胞外基质支架，再植入半月板缺损处，以此来修复损伤的半月板。

在本研究中，我们利用兔SDSCs 与血管内皮细胞为种子细胞，联合小肠黏膜下层（SIS）支架材料三维条件下诱导血管化培养成人工半月板组织材料，随后植入损伤的半月板组织，探讨细胞外基质因子诱导血管化组织工程膜修复兔膝关节半月板损伤的潜能及可行性。我们通过血管化的人工半月板组织材料与未血管化培养的滑膜间充质干细胞-内皮细胞-小肠黏膜下层复合材料、小肠黏膜下层支架材料及自发修复之间的比较，确定了血管化培养的滑膜间充质干细胞-内皮细胞-小肠黏膜下层复合材料植入半月板损伤处后，其修复程度及速度均较其他对照组佳，有助于成功构建具有精确形态的组织工程化半月板。

此外，目前对于干细胞分化结合人工半月板移植，较多的层面还停留在单纯简单的单细胞分化，未涉及到半月板组织的血管化组织工程[12]。这类人工半月板组织虽然能简单的替代半月板组织，具有了半月板软骨细胞和细胞外基质，但对于半月板组织的血管化来说，还有待进一步的探索，有导致后期的半月板软骨细胞坏死等的可能[13-14]。而我们的实验研究则是将SDSCs 和血管内皮细胞联合作为种子细胞，联合小肠黏膜下层支架材料在三维条件下诱导培养3 周后，可见明显的血管化组织。我们将其植入半月板损伤处后通过GAG 含量测定均与正常半月板相近，这些实验数据均证明了人工复合物组织已构建成完整的具有一定力学强度且成熟软骨组织形态的人工组织工程化半月板，且残存的未降解材料量较少。该实验结果表明这种实验方案保证了软骨的良好形成及降低了回植体内后的炎症反应。此外，生物力学测试结果表明，血管化人工半月板的弹性模量较高，更接近正常人的半月板。

同时，本研究发现在以SDSCs 与血管内皮细胞为种子细胞，联合小肠黏膜下层支架材料三维培养时，SDSCs 与血管内皮细胞相容性、相邻细胞贴靠小肠黏膜下层支架交织生长。A 组毛刺状突起明显多于其他对照组，B 组可见少许毛刺状突起，证实了A 组血管化明显高于其他各组，这提示血管化后的人工半月板组织更有利于损伤半月板的修复。

综上所述，本研究证实了SDSCs 具有软骨细胞分化能力，并与血管内皮细胞相容性较好；同时证实了血管化后的人工半月板组织较单一的人工半月板组织更能修复半月板的损伤。本实验不仅为细胞治疗的临床转化研究提供了一定的理论基础，而且为以后半月板修复方法研究鉴定了良好的基础。具有一定的借鉴意义。