李 芳，关 爽

口腔癌(oral cancer)是颌面部常见的恶性肿瘤，超过90%的口腔癌病理类型是口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)，尽管近几十年来在手术、放疗、化疗等方面取得了巨大进展，但口腔癌患者的5年生存率未见明显改善[1]。癌细胞往往对化疗药物产生耐药性，最终导致化疗的失败[2]。因此提高口腔癌的治疗水平，尤其是寻找安全有效的抗口腔癌药物辅助抗癌至关重要。没食子酸(gallic acid, GA)又被称作五倍子酸，有研究表明，没食子酸能够抑制OSCC细胞增殖，促进细胞凋亡[3]，但是没食子酸能否诱导OSCC发生自噬及其作用机制尚不明确。本研究采用体外实验探讨没食子酸通过诱导OSCC自噬作用抑制口腔癌，初步探讨其抑制PI3K/Akt/mTOR通路的作用机制，为没食子酸作为抗口腔癌辅助药物的临床应用研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞系

人舌鳞癌细胞系SCC15(江苏凯基生物技术股份有限公司购买)。

1.2 试剂和抗体

没食子酸和MDC染色试剂盒购自凯基公司；MTT购自Solarbio公司；p-Akt抗体购自英国Abcam公司；p-mTOR多克隆抗体、Beclin 1多克隆抗体、LC3BⅠ/Ⅱ多克隆抗体购自万类生物科技有限公司。

1.3 实验设备

医用超净工作台购自苏州净化设备有限公司；恒温孵育箱购自美国Queue System公司；生物倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司；伯乐Bio-rad垂直电泳系统购自BIO-RAD Laboratories。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 人舌鳞癌细胞系SCC15(江苏凯基生物技术股份有限公司提供)细胞置于含10% FBS、100 U/mL青-链霉素混合液的DMEM/F12培养液中，37 ℃、5% CO2细胞培养箱恒温培养。收集对数生长期细胞进行实验。

1.4.2 MTT实验 生长状态良好的SCC15细胞接种于96孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，细胞密度为1.0×104个/孔，培养 24 h。待细胞贴壁后分别加入0、30、60、90、120、150、300、600 μmol/L的没食子酸100 μL，每组分设4个复孔。然后置于培养箱分别培养24、48 h。MTT检测前，每孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液孵育4 h，弃去上清，每孔加入200 μL二甲基亚砜(DMSO)溶液，结晶充分溶解后，酶联检测仪的波长调整为490 nm，检测每孔的光密度值(OD值)，然后计算SCC15细胞增殖率。抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.4.3 MDC染色法 分组将SCC15细胞于24孔板内爬片至所需要的密度，加药(0、150、300 μmol/L没食子酸)处理48 h；每孔加入100 μL MDC染色工作液(以 1×Wash Buffer：MDC染色液体积比=9∶1 稀释染色液至工作浓度)，室温避光染色20 min 后，弃去染色液，以1×Wash Buffer，300 μL 洗3次，以防淬灭封片剂封片后，荧光显微镜拍照。

1.4.4 Western blot检测相关通路蛋白 SCC15细胞加入0、150、300 μmol/L没食子酸培养48 h后，PBS清洗3遍后，加入RIPA裂解液(含苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制剂)冰上裂解30 min；将液体移入EP管中，置于高速低温离心机中，12 000 r/min、4 ℃、10 min，吸出上清液，BCA方法测定蛋白浓度。取20 μL 蛋白上样跑电泳，转膜，封闭，一抗4 ℃孵育过夜，等渗缓冲盐溶液(TBST)洗膜10 min×3次，二抗室温孵育至少1 h，TBST洗膜10 min×3次，化学发光显色。

1.5 统计学方法

所有统计分析均使用SPSS 22.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 MTT法检测没食子酸对SCC15细胞增殖的影响

没食子酸的浓度分别为30、60、90、120、150、300、600 μmol/L作用SCC15细胞24 h后，SCC15细胞增殖的抑制率分别为(1.40±2.80)%、(2.48±2.25)%、(11.83±5.16)%、(20.15±8.91)%、(31.47±2.13)%、(41.09±0.79)%、(59.21±2.61)%，IC50=421.6 μmol/L；作用48 h后，SCC15细胞增殖的抑制率分别为(5.70±7.13)%、(11.44±5.40)%、(19.96±11.61)%、(32.41±2.07)%、(41.48±1.27)%、(55.54±2.82)%、(71.93±6.67)%，IC50=273.8 μmol/L，结果见图1。90、120、150、300、600 μmol/L没食子酸作用于SCC15细胞24、48 h后，SCC15细胞抑制率与空白对照组相比显著增加(P<0.05)，且有一定的剂量依赖关系。

与对照组比较，#表示24 h抑制率P<0.05；*表示48 h抑制率P<0.05图1 不同浓度的GA作用SCC15细胞不同时间后对细胞增殖抑制率的影响Fig.1 Inhibitory rates of proliferation of SCC15 cells at various time points after treatment with GA under various concentrations

2.2 MDC染色法检测没食子酸对SCC15细胞自噬体形成的影响

0、150、300 μmol/L的没食子酸分别作用于SCC15细胞48 h之后，MDC检测结果显示，150 μmol/L没食子酸组：细胞中散布于细胞质及核周的点状荧光颗粒(即自噬体)增多不是很明显；300 μmol/L没食子酸组：细胞中散布于细胞质及核周的点状荧光颗粒显著增多。结果如图2所示。

图中白色箭头，标记散布于细胞质及核周的染有MDC荧光的自噬体呈点状结构图2 不同浓度没食子酸对SCC15细胞自噬体形成的影响( ×400)Fig.2 Effect of different concentrations of GA on autophagosome formation in SCC15 cells ( ×400)

2.3 Western blot检测没食子酸对SCC15细胞增殖及自噬蛋白表达的影响

0、150、300 μmol/L的没食子酸分别作用于SCC15细胞48 h之后，Western blot分析显示，与对照组相比较，p-Akt蛋白的表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。p-mTOR蛋白的表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。与对照组相比较，细胞内自噬相关蛋白Beclin1的表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，如图5所示。没食子酸还促进了SCC15细胞内LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化，使LC3Ⅱ的表达显著性增加(P<0.05)，如图6。

*：与对照组比较，P<0.05图3 不同浓度没食子酸对SCC15细胞p-Akt蛋白表达的影响Fig.3 Effect of different concentrations of GA on the protein expression of p-Akt in SCC15

*：与对照组比较，P<0.05图4 不同浓度没食子酸对SCC15细胞p-mTOR蛋白表达的影响Fig.4 Effect of different concentrations of GA on the protein expression of p-mTOR in SCC15

*：与对照组比较，P<0.05图5 不同浓度没食子酸对SCC15细胞Beclin1蛋白表达的影响Fig.5 Effect of different concentrations of GA on the protein expression of Beclin1 in SCC15

*：与对照组相比，P<0.05图6 不同浓度没食子酸对SCC15细胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达的影响Fig.6 Effect of different concentrations of GA on the protein expression of LC3Ⅱ/Ⅰin SCC15

3 讨 论

2018年全球范围内口腔癌新发病例354 864人次，死亡病例177 384人次，死亡率在常见癌症中位于第14位[4]。在我国口腔癌的预防和治疗仍然是一个重要的难题，寻找行之有效的辅助治疗药物是我们当今阶段迫切需要解决的问题。临床上预防治疗口腔癌理想的化学药物应具有无毒或毒副作用很小、可口服、高效、作用机制明确、人们易于接受、价格低廉等特征。天然提取物有取材丰富、毒副作用小等优势，逐渐成为当今研究的热点[5-7]。

没食子酸是一种天然多酚类化合物，在自然界广泛存在，如水果、茶叶等植物中。利用小鼠做没食子酸的急性毒性试验，当没食子酸的摄入浓度达到5 g/kg体质量时，仍然没有发现小鼠有死亡或者急性中毒的现象[8]。本研究中应用MTT的方法检测没食子酸对SCC15细胞增殖的抑制率，发现没食子酸达到一定浓度时对SCC15细胞的增殖有一定的抑制作用。有学者研究发现没食子酸降低了SCC4的细胞活性、诱导SCC4的DNA损伤，且存在剂量依赖性关系[9]，这与本研究的结果一致。Lu等研究发现，没食子酸可能通过诱导线粒体凋亡和激活ATM-JNK(c-Jun基末端激酶)信号通路，促进OSCC的细胞凋亡[10]，但没食子酸对自噬作用的相关研究尚未见报道。

MDC是一种相对特异性自噬标记物，它可被细胞吸收并选择性地聚集于自噬体中[11]。通过显微镜可观察到染有MDC荧光的自噬体呈点状结构，散布于细胞质及核周，因此可根据细胞内荧光颗粒的变化来推断自噬的活化。本研究MDC染色结果显示，300 μmol/L没食子酸组细胞中散布于细胞质及核周的点状荧光颗粒显著增多，提示没食子酸可以诱导SCC15细胞发生自噬。

PI3K/Akt/mTOR信号通路是细胞自噬与增殖的主要调节通路[12-15]，Akt与mTOR是这条通路上重要的介导分子，Akt的磷酸化(即p-Akt)是PI3K/Akt通路激活的检测指标。mTOR是自噬的负性调节因子，p-mTOR是其被激活后的磷酸化形式，进而影响下游的自噬相关蛋白的表达[16]。Beclin1是自噬的核心调节因子；在自噬体形成过程中，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化，与自噬体的形成密切相关[17]。Western blot分析显示，150、300 μmol/L的没食子酸可以降低p-Akt和p-mTOR蛋白的表达；细胞内自噬相关蛋白Beclin1的表达明显增加；没食子酸还促进了SCC15细胞内LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化，使LC3Ⅱ蛋白的表达显著性增加。没食子酸可诱导SCC15细胞自噬和抑制细胞增殖，其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR通路，进而上调自噬相关蛋白Beclin1、LC3的表达有关。

没食子酸的提取工艺相对简单；可以口服，生物利用度高[18]；对多种肿瘤有较强的杀伤作用，且对于正常和健康的细胞毒副作用较低[19-20]，能为广大患者所接受。本研究探讨没食子酸对人舌鳞癌SCC15细胞增殖及自噬作用的影响及其可能的作用机制，为没食子酸今后作为口腔癌化学预防和放化疗辅助用药提供实验基础。