朱品欢 燕兰云 徐 欢 万 琪

（南京医科大学第一附属医院神经内科，南京210029）

偏头痛是一种常见的、多因素的、致残的、复发的、具有遗传特点的慢性神经血管性头痛，其病情特征为反复发作、一侧或双侧搏动性的剧烈头痛且多发生于偏侧头部[1]。我国偏头痛病人女性居多，与男性之比约为3:1。根据最新的全球疾病负担显示，在 50 岁以下的人群中偏头痛已跃居致失能性疾病排行榜第一位[2]。其持续存在严重影响病人的生活质量，因此深入探究偏头痛的发病机制对其预防及治疗有重要的临床意义。

近年来，小胶质细胞与偏头痛之间的关系受到越来越多的关注。小胶质细胞作为中枢神经系统内重要的免疫效应细胞，细菌感染、周围神经创伤、癌症、脊髓创伤等因素均可使其激活[3]。一方面，小胶质细胞在中枢神经系统损伤后发挥呈递抗原、吞噬病原体、分泌多种细胞因子和神经修复作用；另一方面，也能分泌一些炎症因子、谷氨酸、NO等加重炎症反应，引起继发损伤[4]。研究已证实在反复硬脑膜炎性汤(inflammatory soup, IS)刺激诱导的慢性偏头痛模型中，三叉神经脊束尾核 (trigeminal nucleus caudalis, TNC) 小胶质细胞明显活化且对大鼠痛觉超敏的调控有重要作用[5]。在周围神经损伤后，P2Y6、P2Y11、P2Y12、P2Y13 和P2Y14mRNAs 在同侧脊髓小胶质细胞内的含量均出现不同程度的上调[6～8]，这表明P2Y 家族的受体可能在激活脊髓小胶质细胞导致神经疼痛的过程中起到一定作用。P2Y14 作为一种抑制环磷酸腺苷合成的Gi (inhibitory adenylate cyclaes g protein, Gi) 蛋白偶联受体，能够被4,7-二取代的二萘酸衍生物 (4,7-disubstituted 2naphthoic acid derivative, PPTN)，一种P2Y14 受体的高亲和力竞争性拮抗剂所抑制[9,10]。

本研究参考了文献[11～13]，在大鼠横窦区硬脑膜上连续给予IS，建立偏头痛大鼠模型。观察IS 与PPTN 对实验大鼠眶周痛觉阈值及颈髓C1-C2后角P2Y14 受体、小胶质细胞与偏头痛中枢敏化之间的关系，以此来更好地了解偏头痛的产生和发展过程。

方 法

1.实验动物及分组

清洁级6 周龄成年雄性SD 大鼠42 只，体重180～220 g，购自南京医科大学医药实验动物中心，许可证号SYXK(Su)2015-0015。饲养环境温度控制在21～22℃，保持12 h/12 h 明暗间隔的人工昼夜节律，自由摄食和饮水。对实验动物进行的所有研究行为均严格遵照国际疼痛学会(International Association for the Study of Pain, IASP) 的相关动物保护及使用规定，并获得南医大实验动物中心动物伦理委员会批准。大鼠采用随机数字表法分为：(A)生理盐水(NS) 组、(B)“炎性汤”4 天(IS4d)组、(C)“炎性汤”7 天(IS7d)组、(D) PPTN 治疗组、(E) PPTN 治疗对照组、(F) PPTN 预防组、(G) PPTN 预防对照组，每组6 只。其中A、B、C 组为干预前组，这三组相互比较以明确炎性汤IS 对大鼠偏头痛中枢敏化的影响。D、E、F、G 组为干预后组，D、E两组相互比较以明确PPTN 治疗对大鼠偏头痛中枢敏化的影响，F、G 两组相互比较以明确PPTN 预防对大鼠偏头痛中枢敏化的影响。

2.方法

（1）手术准备及硬脑膜给药：实验大鼠在动物房饲养3 天后开始进行造模。以10%水合氯醛0.4 ml/100 g 腹腔注射大鼠，待其麻醉后，将大鼠固定于立体定位仪上，依次剪开皮肤及软组织暴露颅骨。骑跨人字缝用牙科钻钻开颅骨(3 mm×3 mm)，暴露横窦。置入PE10 软管（宁波安来公司），软管末端开口于横窦区硬脑膜，用钻开的颅骨重新覆盖暴露的横窦，并将PE10 管固定于颅骨上，打火机封闭PE10 管另一端。术后将被手术大鼠单笼饲养并监测其状态及眶周痛阈值，经观察得知术后第4 天大鼠眶周痛觉阈值基本恢复至基础水平。于术后第4 天开始经PE10 软管给药。将大鼠放入有给药窗的固定器中，暴露PE10 管，剪去被打火机封闭的一端，待其安静后，给予无菌IS10 μl（IS包含2 mmol/L组胺、5-羟色胺、缓激肽及0.2 mmol/L 前列腺素E2，稀释于无菌的PBS 中）或无菌NS 10 μl 或无菌P2Y14 抑制剂PPTN10 μl，5 min 匀速给完（IS 药物及PPTN均购自Sigma 公司）。IS4d 组和IS7d 组从术后第5天起于每日固定时间经PE10 管给予IS 一次，分别给予4 天和7 天。NS 组则在每日相应时间经PE10管给予与IS 相同体积的无菌NS。PPTN 预防组在术后第4 天固定时间经PE10 管给予PPTN 一次，术后第5～11 天于固定时间依次给予PPTN 及IS 各1 次，连续7 天。预防对照组则在相应时间经PE10管给予与PPTN 相同体积的无菌NS。根据前期实验可知，大鼠硬脑膜给予IS 后第3 天出现痛觉超敏，故PPTN 治疗组在术后第5～7 天于每天固定时间经PE10 管给予IS 一次，连续3 天，术后第8～11天于每天固定时间经PE10 管依次给予IS 及PPTN各1 次，连续4 天。治疗对照组则在相应时间经PE10 管给予与PPTN 相同体积的无菌NS。

（2）眶周痛觉阈值测定：按参考文献[14]方法，每天相同时间点将大鼠置于透明固定器中，安静30 min 后，用vonFrey 纤维丝悬于大鼠一侧眶周皮肤上，相互垂直，从最小克数 0.008 g （Iog值1.65）开始刺激眶周皮肤，逐步增加至最大克数 300 g。以纤维丝弯曲 90°为标准，并在刺激部位停留 2 s，刺激 5 次为一循环，每次刺激之前间隔 3 s。若在 5 次刺激中有 3 次及以上出现大鼠用前爪拨开纤维丝、发动攻击或缩头缩爪等行为表现，则判定该大鼠出现痛觉超敏，并记录此时刺激克数为疼痛阈值。若刺激克数达到 300 g，但仍未出现上述痛觉超敏表现，则将 300 g 记为其痛阈值。实验表明，出现痛觉超敏的大鼠，其疼痛阈值多在 15 g 以下。

（3）Western Blot：将颈髓C1-C2组织剪切成小块，加入适量的冰冷PBS 洗涤2 次后称重。每20 mg 组织加入100 μl 裂解液和相应的磷酸酶抑制剂，每个试管加入2 个直径2 mm 的磁珠，将其放入组织匀浆机中，60 Hz，300 s。充分裂解后，将试管放入离心机中，12 000 r 离心15 min。取上清。将上清液煮沸5 min，然后将收集到的蛋白进行SDS-PAGE 处理。在室温下用5%脱脂奶粉的TBST封闭液室温孵育PVDF 膜，置于摇床温柔摇晃1 h；在4℃条件下，分别用一抗Iba-1(1:2000)、P2Y14 (1:2000)和内参β-actin (1:2000)置于摇床孵育过夜；TBST 清洗3 次，每次5 min；二抗孵育：按说明书稀释相应二抗，室温孵育置于摇床温柔摇晃2 h；TBST 清洗8 次，每次8 min；将ECL、发光液A液和B 液混合(1:1)，均匀覆于膜后，置于Bio-Rad凝胶成像系统成像；Western blot 条带经Image J 软件进行灰度扫描分析。

（4）免疫荧光：以10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠，经左心室插管至升主动脉，以0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液冲洗血液后，取脊髓颈段(C1、C2)置于4%多聚甲醛中固定2 h，随后依次置于20%、30%蔗糖溶液脱水直至颈髓组织沉底。包埋组织并连续冠状切片，片厚15 μm。加入0.3% Triton-X100 及10% BSA 中室温封闭60 min。加入相应的一抗山羊抗大鼠Iba-1 (1:100, Abcam)，4℃过夜。后加入荧光二抗FITC 荧光素标记的驴抗山羊IgG (1:600, Abcam)，贴片、滴加抗淬灭剂、封固，在激光共聚焦显微镜下观察结果（×20倍和×40倍）。

图1 术后不同时间大鼠眶周痛阈值Fig. 1 Periorbital pain threshold of rats at different time after operation

3.统计学分析

采用GraphPad Prism 5.0 统计软件，实验数据结果以均数±标准差(±SD)表示计量资料，两组间比较用t检验，多组比较用单因素或两因素方差分析，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.反复硬脑膜炎症能诱导大鼠眶周痛觉超敏

术前各组大鼠眶周痛阈值均维持在同一基础水平，颅骨手术后各组大鼠眶周痛阈值会出现短暂性下降，但均于术后第4 天恢复至基础值（见图1）。NS 组与空白组之间眶周痛阈值之间的差异无统计学意义（见图2）。自给药第3 天开始，与NS 组和空白组相比，IS4d 和IS7d 组大鼠眶周痛阈值明显降低至痛觉超敏水平以下（P＜ 0.001，见图2）。

2.小胶质细胞在偏头痛形成早期起促进作用

已有研究表明小胶质细胞参与偏头痛的早期发展[5]。因此，根据文献[11～13]建立了SD 大鼠偏头痛模型，以推进本研究。由图2 可知，与NS 组相比，IS4d 组和IS7d 组的大鼠眶周痛阈值显著降低,特别从第3 天起（P＜ 0.001，见图2），且IS4d 组和IS7d 组的下降趋势基本一致，这表明偏头痛大鼠模型造模是成功的。之后用Western Blot 方法检测了颈髓C1-C2节段中小胶质细胞特异性蛋白Iba-1 的表达情况，并将各组中Iba-1/β-actin 的比值进行统计学分析。发现Iba-1 的表达量在IS4d 组和IS7d 组显著上升，而在NS 组中则没有这种现象（P＜ 0.001，见图3），其中IS4d 组Iba-1 蛋白的含量较IS7d 组更高（P＜ 0.001，见图3）。免疫荧光结果也证实了这一现象（P＜ 0.01，P＜ 0.05，见图4）。这与之前的研究结果相符[5],即小胶质细胞在偏头痛早期阶段起作用。

图2 不同给药时间大鼠眶周痛阈值Fig. 2 Periorbital pain threshold of rats with different administration time

3. P2Y14 受体与小胶质细胞表达量变化趋势一致

在检测小胶质细胞特异性蛋白Iba-1的含量后，随即检测了颈髓C1-C2组织中P2Y14 受体的含量。其中P2Y14 蛋白存在两条条带，对其进行了统一分析。本研究发现IS4 组P2Y14 受体水平最高，IS7组次之，NS 组最低（P＜ 0.001，见图5），这与我们之前发现的Iba-1 蛋白的变化趋势相同。这说明，P2Y14 蛋白可能与小胶质细胞之间存在一定的相关性。

4. PPTN 可减少P2Y14 受体和小胶质细胞的表达量并减轻痛觉超敏的程度

图3 NS 组、IS4d 组和IS7d 组颈髓C1-C2 节段Iba-1 蛋白表达情况Fig. 3 Iba-1 protein expression in C1-C2 segment of cervical spinal cord in NS group,IS4d group and IS7d group

据文献报道，PPTN 经注射后将在30 min 以后发挥作用[10]，因此本研究在硬脑膜给予IS 的前1 天在预防组中加入了PPTN 作为PPTN 预防组，或加入NS 作为预防对照组。从结果可以看出，与预防对照组相比，PPTN 预防组大鼠眶周痛阈值下降幅度明显减缓，甚至在给予PPTN 后第4 天开始，预防组的眶周痛阈值缓慢上升（P＜ 0.05，见图6A）。同样,在硬脑膜给予IS 后第4 天加入PPTN，能有效地减缓偏头痛模型大鼠眶周痛阈值的下降，与NS 治疗组相比，PPTN 治疗组眶周痛阈值的减缓效果具有统计学意义（P＜ 0.05，见图6B）。用Western Blot 检测了各组中Iba-1/β-actin和P2Y14/β-actin 的表达量，结果发现在PPTN 预防组和PPTN 治疗组中含量均明显低于各自相应对照组，差异具有统计学意义（P＜ 0.001，见图6C、D）。同时，免疫荧光结果显示，在使用了PPTN 预防或治疗后，大鼠颈髓组织中Iba-1 的形态和数量与各自对照组相比均有明显的减弱，差异具有统计学意义（P＜ 0.05，见图7）。

图5 NS 组、IS4d 组和IS7d 组颈髓C1-C2 节段P2Y14受体表达情况Fig. 5 P2Y14 receptor expression in C1-C2 segment of cervical spinal cord in NS group, IS4d group, and IS7d group

图6 PPTN 预防组和PPTN 治疗组对大鼠眶周痛阈值以及颈髓C1-C2 节段Iba-1 和P2Y14 受体表达的影响Fig. 6 Periorbital pain threshold of rats with different administration time and expression of IBA-1 and P2Y14 receptors in C1-C2 segments of cervical spinal cord in PPTN prevention group, PPTN treatment group, and their respective control groups

图7 PPTN 预防组和PPTN 治疗组和各自对照组中颈髓C1-C2 节段Iba-1 免疫荧光检测（图中前三行标尺为20 µm，最后一行标尺为40 µm）Fig. 7 The immunofluorescence of IBA-1 in C1-C2 segment of cervical spinal cord in PPTN prevention group, PPTN treatment group and their respective control groups (the bar scales in the first three lines are 20 μm, and in the last line are 40 μm)

讨 论

偏头痛的治疗一直是世界性的难题，会对病人的生活产生负面影响，并导致许多伴随症状，如头晕、恶心、呕吐等自主神经功能障碍。当中枢神经系统受损时，小胶质细胞迅速激活，对外界刺激如迁移、增殖、形态改变、免疫因子和炎症介质的释放等做出反应，参与细胞碎片的吞噬。现在已经证实，在中枢神经系统中，神经元向周围的胶质细胞（星形胶质细胞和小胶质细胞）发出信号，这些神经细胞被激活后，在病理状态下会引起偏头痛和持续的神经炎症[3,15]。

在本研究中，小胶质细胞确实在偏头痛发展的早期就被激活，Western Blot 结果显示，IS4 组的小胶质细胞中特异性蛋白Iba-1 的含量明显高于IS7组。同样的现象也可以在免疫荧光结果中看到。IS4组激活的小胶质细胞数量明显高于IS7 组，虽然部分激活的小胶质细胞形态不如IS7 组饱满，突触未完全展开，但均有明显的激活。因此，这是一个强有力的证据，证明小胶质细胞只在偏头痛的早期阶段起作用，其水平在偏头痛的中后期缓慢下降。

研究表明，小胶质细胞中P2Y 家族的8 个受体，除P2Y14 受体主要与血管性疾病和神经胶质瘤等相关外[16,17]，其余受体均被证实与小胶质细胞和炎性痛觉过敏有关。为了探讨P2Y14 受体、小胶质细胞与偏头痛这三者之间的关系，本研究检测了实验大鼠IS4、IS7、NS 组的颈髓C1-C2组织中P2Y14 受体的含量。发现SD 大鼠偏头痛模型中P2Y14 受体的变化与Iba-1 的变化趋势一致，即含量由高到低依次为IS4 组、IS7 组和NS 组。也就是说，P2Y14受体在小胶质细胞中表达，或者两者之间存在对应关系。因此，我们怀疑P2Y14 受体可能通过小胶质细胞参与偏头痛超敏反应的形成。为了检测P2Y14受体是否在偏头痛模型中起作用，本研究加入其抑制剂PPTN 对实验大鼠进行了一系列的预防和治疗实验。通过结果发现，在偏头痛模型造模前1 天加入PPTN 不仅明显减少了P2Y14 受体和小胶质细胞的表达，还可以有效预防眶周痛阈值的下降，治疗组亦是如此。

Curet 等[17]发现，在体外培养的神经胶质瘤GL261 细胞，其小胶质细胞中的P2Y14 受体含量是上调的，并且在使用了选择性P2Y14 受体激动剂UDP glucose 后，细胞内出现了一系列与P2Y14 受体增高相关的变化，而由于GL261 细胞不能单独表达P2Y14 受体，因此他们认为UDPG 所产生的作用可能是由小胶质细胞介导的。这与本研究存在一定的类似性。在偏头痛痛觉超敏模型中，小胶质细胞内P2Y14 受体含量上调，而使用PPTN 抑制了P2Y14 受体的表达后，小胶质细胞激活量下降，痛觉超敏程度降低。这些现象均表明，P2Y14 受体确实参与了小胶质细胞介导的偏头痛的产生，抑制P2Y14 受体的表达可能通过减少小胶质细胞的活化进而减轻偏头痛痛觉超敏的形成及其疼痛的程度。

综上所述，P2Y14 受体与小胶质细胞之间存在一定的对应关系。在经IS 诱导的偏头痛大鼠模型中，颈髓C1-C2后角小胶质细胞明显被激活，且早期被激活的情况更为明显，后期数量逐渐减少。预先给予P2Y14 受体抑制剂PPTN 处理能明显抑制痛觉超敏现象及小胶质细胞特异性蛋白Iba-1 的表达。同时，在实验SD 大鼠已经出现痛觉超敏现象后再给予PPTN 亦能减轻痛觉超敏的程度及Iba-1 的表达。这表明P2Y14 受体确实通过激活小胶质细胞进而参与了偏头痛痛觉超敏的形成，抑制P2Y14 受体可以有效预防偏头痛病人痛觉超敏现象的发生和发展，从而改善病人生活质量。但有关P2Y14 受体究竟是通过何种途径激活小胶质细胞从而参与中枢敏化，还有待进一步研究。