吴小祥 朱 娜 邢亚群▲

1.蚌埠医学院第二附属医院药剂科，安徽蚌埠 233030；2.中国医学科学院北京协和医学院生物医学工程研究所，天津 300192

羟基喜树碱（hydroxycamptothecin，HCPT）是从中国珙桐科植物喜树中提取的一种吲哚类生物碱，能选择性作用于拓扑异构酶Ⅰ发挥抗肿瘤作用，广泛应用于肝癌、肺癌、宫颈癌、白血病等多种恶性肿瘤的治疗[1-2]。然而羟基喜树碱在水及有机溶剂中溶解性差，且内酯环结构不稳定降低了其的抗肿瘤活性。目前，现有的HCPT注射液在体内半衰期极短，需要频繁给药，故在临床应用中受到了较大的限制[3-4]。因此，寻求一种能提高生物利用度、降低毒副作用的新制剂对肿瘤患者的治疗有重要的现实意义。

聚乳酸/羟基乙酸共聚物[poly（lactic-coglycolic acid），PLGA]是一类具有良好生物相容性，无毒且无免疫原性的高分子材料；因其具有良好的成囊和成膜性能，可在体内生物降解为CO2和水，已被FDA批准用于医用注射用微球、微囊、植入剂等制剂的辅料[5-7]。

本课题组探索了基于PLGA负载羟基喜树碱的纳米微球，考察体外释放行为在大鼠体内的药代动力学和组织分布特征，旨在制备出具有长效缓释、生物利用度高、副作用低的新型制剂，为HCPTPLGA纳米微球应用于临床肿瘤靶向治疗提供新的实验参考和理论依据。

1 实验材料

1.1 仪器

Alliance高效液相色谱系统，包括2695型高效液相色谱仪、2998型二极管阵列检测器和Empower3工作站等（美国Waters公司）；扫描电镜（JSM-T330A，日本）；激光粒度分析仪（Zetasizer，英国Malvern公司）；G285型电子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）；Thermo ST16R（美国赛默飞世尔科技有限公司）；KQ2200DE型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。

1.2 试药

HCPT（纯度＞98%，上海摩楷生物科技有限公司）；HCPT对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100532-200401，纯度＞98%）；HCPT-PLGA（自制，生产批号：190405）；聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA，MW=50 000，LA∶GA=50∶50，济南岱罡）；聚乙烯醇（PVA，分子量30 000～70 000，Sigma公司）；吐温80（国药集团）；乙腈为色谱纯；水为Millipore超纯水；其余试剂均为分析纯。

1.3 动物

健康SD雄性大鼠，体重200～240g，由蚌埠医学院实验动物中心提供。

2 方法与结果

2.1 HCPT-PLGA纳米微球的制备

W1/O/W2型乳化-溶剂挥发法制备HPTCPLGA纳米微球。首先在一定量的PLGA二氯甲烷溶液（O）中加入规定量的HCPT溶液（W1），冰浴下超声乳化制得初乳；将初乳液迅速滴加入10mL 3%的PVA溶液（W2）中，1000rpm，磁力搅拌2min成复乳；复乳液加入去离子水30mL，500rpm磁力搅拌过夜，使二氯甲烷完全挥发；将混合液于10 000r/min转速下冷冻离心5min，除去未包裹的HCPT等杂质，去离子水洗涤3次，冷冻干燥后4℃保存。

采用激光粒度仪测定HCPT-PLGA纳米微球的粒径分布和Zeta电位。取适量HCPT-PLGA用蒸馏水分散均匀，在石英皿中加入20μL溶液，并用蒸馏水滴加至标记线，结果见图1A。可见，HCPT-PLGA的粒径分布较为均匀，平均粒径为（237.2±2.15）nm，分散指数（PDI）为0.29，Zeta电位为-（34.0±1.1）mV，表明纳米粒具有良好的分散性和稳定性。在扫描电镜下观察形态，可见粒子均匀性较好，呈较规则的球形，见图1B。

图1 HCPT-PLGA纳米微球的粒径分布及扫描电镜图

2.2 色谱条件

采用HPLC法测定HCPT含量，色谱条件为Kromasil C18柱（5μm，4.6mm×250mm）；流动相:乙腈-水（含0.05%甲酸）=25∶75；流速：1.0mL/min；紫外检测器，检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量为20μL。

2.3 体外释放动力学

采用动态透析袋法（MWCO=8000）考察载药HCPT-PLGA在含1%吐温80生理盐水中的释药情况。分别精密吸取2.0mL HCPT-PLGA溶液以及等量浓度的HCPT溶液，置于透析袋内，每组平行3份，将袋口扎紧后浸入释放介质中。在37℃，100r/min条件下搅拌，且隔一定时间取样1.0mL，并补充等量新鲜介质。样品经0.45μm微孔滤膜后高效液相进样，得药物浓度。由图2可知，游离HCPT在开始阶段迅速释放进入介质中，8h时累积释放率接近80%，此后药物的释放趋于平缓，至12h时几乎释放完全；而载HCPT的PLGA纳米微球的释放明显缓慢，前12h内药物累积释放率为55%，12h后载药纳米微球中HCPT的释放呈现缓慢上升，72h时累积释放率为79%。

图2 HCPT与HCPT-PLGA体外释药曲线

2.4 样品处理方法

血样：大鼠眼眦静脉丛采血0.5mL，置于含有肝素的离心管中，10 000r/min离心15min，精密吸取血浆100μL，涡旋混合均匀，精密吸取200μL乙腈沉淀蛋白，充分涡旋混合，于10 000r/min离心15min，取上清液进样分析（或4℃冰箱备用）。

组织样品：分别取大鼠心、肝、脾、肺、肾、直肠组织，称重后按照1∶3的比例加入生理盐水，于高速匀浆器上制成组织匀浆，10 000r/min离心15min。取上清200μL，以400μL的乙腈沉淀蛋白，10 000r/min再次离心15min，取匀浆上清液进样分析（或4℃冰箱备用）。

2.5 方法学考察

2.5.1 系统适用性实验 在选定的色谱条件下，HCPT-PLGA中的其他成分和血浆组织样品中的内源性成分不干扰HCPT的测定，具体见图3，其中HCPT出峰时间在10.5min左右。

图3 高效液相色谱图（A为HCPT溶液；B为空白血浆；C为血浆样品+HCPT）

2.5.2 线性关系考察 精密称取HCPT对照品2.4mg，置于25mL量瓶中，加甲醇溶解定容，得到HCPT储备液。分别取空白血浆或空白组织匀浆100μL，加入适量HCPT溶液，得质量浓度分别为0.075、0.15、0.75、1.50、6.00、24.00、48.00μg/mL的HCPT标准液。以峰面积（A）为纵坐标（Y），HCPT浓度（C）为横坐标（X）进行回归，HCPT标准溶液在0.075～48.000μg/mL范围内线性良好，标准曲线为：Y=43.02X-0.8741，r=0.9996。结果表明，血浆样品及各组织样品在0.075～48.00μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系，定量限为0.075μg/mL。

2.5.3 提取回收率与精密度测定 精密量取HCPT质量浓度分别为0.15、1.5、24.0μg/mL的溶液，20μL进样后记录峰面积为A1。另取空白血浆或空白组织匀浆100μL，加入上述不同浓度的HCPT，按“2.4”项下方法进行处理，20μL进样后记录峰面积为A2，每个质量浓度测定3次。以A2/A1计算回收率。精密量取空白血浆100μL共3份，分别精密加入低（0.15μg/mL）、中（1.50μg/mL）、高（24.00μg/mL）3种浓度的药物标准溶液20μL，按照样品处理方法进行处理，每天分别进样5次，考察日内精密度。1周内连续测定3d，考察日间精密度，记录色谱图及峰面积。结果显示，各浓度样品的平均回收率为（76.39±0.39）%～（89.75±0.272）%，RSD为0.89%～7.63%。日内、日间RSD均＜10%。

2.6 大鼠体内药代动力学实验

取SD大鼠，在实验前禁食12h，自由饮水。每只大鼠尾静脉注射剂量8mg/kg，分别于给药后5、15、30、45、60、90、120、240、360、480min自大鼠眼眦静脉丛用毛细管穿刺取血0.5mL，按“2.4”项下样品处理方法进行。

经DAS2.1.1药代动力学软件处理数据，分析均通过SPSS19.0统计学软件完成，组间比较采用t检验，P＜0.05与P＜0.01为差异有统计学意义。主要药代动力学参数见表1，血药质量浓度-时间曲线图见图4。HCPT溶液在90min左右在体内基本代谢；HCPT-PLGA在480min左右基本代谢。由表1可知，大鼠静脉注射HCPT溶液以及HCPTPLGA体内过程均符合二室模型，清除率CL减小至0.037μg/（mL·min），说明HCPT-PLGA具有更长的释药时间。HCPT-PLGA的曲线下面积AUC0-t约为HCPT的1.9倍，MRT0-∞约为HCPT的1.6倍，表明HCPT-PLGA在体内停留时间较长，半衰期较长，能有效改善药物在体内迅速消除的缺点。

图4 HCPT与HCPT-PLGA给药后的血药-时间曲线

表1 大鼠尾静脉注射普通HCPT与HCPT-PLGA后的主要药代动力学参数（±s，n=5）

表1 大鼠尾静脉注射普通HCPT与HCPT-PLGA后的主要药代动力学参数（±s，n=5）

注：与HCPT方案比较，*P＜0.05，**P＜0.01

参数 HCPT方案 HCPT-PLGA V（mL/μg） 0.33±0.04 0.39±0.02 AUC0-t[μg/（mL·min）] 206.39±12.37 397.02±16.76**AUC0-∞[μg/（mL·min）] 318.07±3.06 506.98±5.41*CL（mL） 0.045±0.003 0.037±0.002 K10（min） 0.147±0.051 0.083±0.006*K12（min） 0.069±0.008 0.051±0.024 K21（min） 0.075±0.013 0.071±0.040 MRT0-t（min） 9.66±0.89 31.12±1.57**

2.7 大鼠体内组织分布实验

分别于给药后5、15、30、45、60、90、120、240、360、480min时间点取心、肝、脾、肺、肾、直肠组织，在有冰块的泡沫盒中匀浆，冷藏静置0.5h，按“2.4”项下方法进行处理样品与“2.2”项下色谱条件下方法进行分析。

图5 HCPT溶液与HCPT-PLGA给药后在心、肝、脾、肺、肾、直肠组织中的浓度（±s，n=5）

采用直方图直观的比较大鼠尾静脉给药后HCPT两种制剂在不同时间点和不同组织中的动态分布情况，见图5。结果表明，HCPT-PLGA在肝部浓集并滞留较长时间。在120min时，HCPT-PLGA药物浓度的分布顺序为肝＞肺＞直肠＞肾＞脾＞心，240min时肝脏中的药物浓度有下降趋势，但仍维持在较高浓度，说明药物能快速到达肝脏并长时间保留。在15min时，HCPT溶液药物浓度的分布顺序为肺＞肝＞直肠＞肾＞脾＞心，虽然给药可以迅速达到较高浓度，但45min后药物浓度显著下降，表明药物虽能快速到达肺部和肝部，但保留时间较短。

2.8 靶向性评价

本实验以相对摄取率（Re）及峰浓度比（Ce）作为评价参数考察普通HCPT和HCPT-PLGA的靶 向 性。其 中Re=AUCHCPT-PLGA/AUCHCPT；Ce=CmaxHCPT-PLGA/CmaxHCPT。结果由表2可知，HCPT-PLGA在肝内的Ce及Re值分别为HCPT的2.94倍及5.51倍。HCPT-PLGA延长了HCPT在肝部的滞留时间，提高了靶向疗效。HCPT-PLGA在肝脏表现出明显的靶向性（Ce和Re分别为27.45和23.40）。

表2 HCPT与HCPT-PLGA在体内的靶向性评价结果

3 讨论

采用改良的W1/O/W2复乳法[8]制备得HPTCPLGA纳米微球的粒径为（237.2±2.15）nm，分散指数为0.29，其粒径大小符合2015版《中华人民共和国药典》静脉注射制剂的要求。Zeta电位的绝对值大于30mV，表明粒子间存在较大的排斥力，有利于纳米溶液的稳定性并促使粒径大小均一[9]。HPTCPLGA纳米微球较大的电位绝对值预示其具备较好的物理稳定性。

参考相关文献[10]，采用动态透析袋法考察HCPT-PLGA纳米微球的体外释药特性，结果表明HCPT-PLGA纳米微球能延缓HCPT的释放，具有长效缓释作用。由于HCPT不溶于水，在体外释放实验中选用生理盐水作为溶出介质时，几乎检测不到药物。另外，如果选择40%乙醇作为释放介质时，溶解迅速但制剂极不稳定。通过查询文献[11]，当选用含0.02%（w/v）吐温80的PBS（pH 7.4）作为HCPT制剂的体外释放介质时，HCPT溶解性及稳定性都会相应提高。综合以上特征，本研究选用了含1%吐温80的生理盐水为HCPT-PLGA纳米微球的释放介质，结果证实此条件既能达到满足漏槽条件，又有效提高了药物的稳定性。

目前，临床对肿瘤的治疗多以羟基喜树碱钠盐注射液进行静脉注射给药，药物分布半衰期为4.23min，消除半衰期小于30min。相关动物实验研究结果表明，羟基喜树碱钠盐注射液在体内快速分布及消除，大鼠尾静脉注射2h后即检测不到血药浓度[12]。本研究中，普通HCPT溶液在给药后迅速进入体循环，90min基本代谢完全，与文献报道相符[13-15]。HCPT-PLGA纳米微球在血浆中药物浓度可维持8h以上，显著延长了药物在体内的作用时间。通过Ce和Re指标的靶向评价结果看出，HCPT-PLGA与普通HCPT溶液对各组织均有一定的靶向性，但是HCPT-PLGA在心、肝、脾、肺、肾、直肠中的质量浓度均显著高于普通HCPT溶液，HCPT-PLGA在大鼠肝与肺的Ce和Re值最大，在肝脏中停留时间最长。血药质量浓度-时间曲线和主要药代动力学参数均表明，HCPT-PLGA可明显提高HCPT在体内的生物利用度，表现出的缓释长效作用与体外释放动力学考察结果一致。针对HCPT-PLGA纳米微球明显的肝靶向性，猜测原因可能与肝脏中富含单核巨噬细胞吞噬系统（mononuclear phygocyte system，MPS），使纳米粒易被其捕获所致有关[16-18]。

近年来对HCPT新剂型的研究仍然处于实验阶段，研究者试图通过各种方法提高HCPT给药后的生物利用度[12,19-21]。本课题组提供的载HCPT的PLGA纳米微球可增加药物的体外释药量，改善体外释放行为，在体外环境下表现出良好的药物缓释性能以及肝靶向特征，可以明显提高HCPT的生物利用度。大鼠体内实验证明HCPT-PLGA纳米微球的肝靶向作用增强，为提高临床肝靶向治疗效果提供了另一种可能。在后续实验中将继续优化制备工艺，提高HCPT的包封率和载药量，并进行肿瘤细胞实验的考察，探索其抗肿瘤作用，以期为临床HCPT新剂型的引入及应用提供新的理论基础。