覃卫娟 李玉蝶 黄娇华

南宁市妇幼保健院检验科，广西南宁 530011

听力受损是最常见的出生缺陷，影响着全世界7千万人口。根据国内外大量研究表明50%以上的听力损失是遗传因素导致[1]，遗传性耳聋主要的遗传模式是常染色体隐性遗传，其次是常染色体显性遗传。随着测序技术的应用，大量的常染色体显性遗传和隐性遗传基因被发现与耳聋相关，GJB3在我国主要的突变位点是c.538C＞T，而SLC26A4基因突变位点主要是c.919-2A＞G[2]。SLC26A4基因突变是引起遗传性耳聋Pendred综合征（pendred syndrome，PDS）/非综合征性前庭导水管扩大（nonsyndromic enlarged vestibular aqueduct，NSEVA）的重要基因。PDS/NSEVA是感觉神经性听力损失（sensorineural hearing loss，SNHL）谱系，通常是先天性，听力损伤从严重到极其严重，同时有前庭功能障碍或伴有颞骨异常，在儿童晚期至成年早期PDS会出现甲状腺功能正常性甲状腺肿的发展，而NSEVA则不包括[3]。SLC26A4基因突变是常染色体遗传性耳聋的第二大遗传因素，耳聋基因变体数据库显示超过400个与耳聋相关的SLC26A4基因致病性位点已经被报道[4]。SLC26A4基因突变具有高度的异质性，SLC26A4在我国主要的致病突变位点是c.919-2A＞G和c.2168A＞G，而在日本、韩国是c.2168A＞G突变[5]，不同的位点在各个区域和民族之间突变有显著差异，为了筛查适合本地区的耳聋基因突变位点，了解本地区壮族孕期女性GJB3和SLC26A4基因突变携带情况，本研究对GJB3和SLC26A4基因进行测序，为产前筛查、产前诊断、新生儿耳聋基因筛查提供遗传咨询数据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年6～12月来自南宁市妇幼保健院产前门诊听力正常的402例壮族孕期女性，在知情同意下抽取孕妇外周血提取DNA，对耳聋基因GJB3、SLC26A4进行全基因测序。本研究遵循医学伦理要求，并取得了南宁市妇幼保健院医学伦理委员会的同意。

1.2 检测方法

使用测序法检测402例孕妇GJB3和SLC26A4基因。（1）文库构建：根据样品量计算需配制的PCR扩增体系，选取目的片段扩增程序进行扩增；（2）文库纯化；（3）文库质检：参照KAPA Library Quantification KitIllumina® platforms TDS对文库进行定量；（4）测序：将文库pooling，变性最终以1.8pM的文库上机测序。生物信息学分析：利用GATK工具判读SNP和Indel位点；利用Snpeff工具注释SNP，最后利用dbSNP、千人基因组数据库、HGMD等数据库、clinvar数据库进行注释和比较分析。

1.3 分类依据

根据耳聋基因变体数据库（http://deafnessvariationdatabase.org/）对突变位点进行分类，分为良性、致病性、可能良性、重要性不明确、新发现位点。

2 结果

2.1 检测结果

对402例壮族孕期女性进行耳聋基因GJB3和SLC26A4测序发现，163例携带有耳聋基因突变，其中GJB3 和SLC26A4分别为99例和64例，携带率较高为40.55%（163/402）。其中携带致病性突变位点21例，GJB3 和SLC26A4分别为2和19例，携带率为5.22%（21/402）。GJB3和SLC26A4复合突变21例。

2.2 GJB3测序结果

对402例壮族孕期女性进行GJB3耳聋基因测序，共发现99例孕期女性携带GJB3突变，突变携带率为24.63%（99/402），共9个突变位点，突变等位基因数104个；其中5个是良性突变位点，重要性不明确位点2个，致病性位点2个。本研究中GJB3常见的突变位点是c.357C＞T和c.53G＞A分别占104个总突变等位基因的74.04%和14.42%，均为良性突变；GJB3重要性不明确突变位点2个，分别为c.474G＞A位点2例，c.131G＞A位点1例；在我国c.538C＞T和 c.547G＞A位点为致病性位点，402例孕期女性中各检出1例，均为杂合突变，GJB3致病位点携带率为0.50%（2/402）。见表1。

表1 402例孕期女性GJB3基因测序结果分析

2.3 SLC26A4测序结果

402例壮族孕期女性SLC26A4基因检测出64例突变，携带率为15.92%（64/402），共33个突变位点,突变等位基因数73个。其中致病性位点共6个，共检出突变19例，等位基因数19个分别为c.1983C＞A、c.1547dup、c.754T＞C、c.1905G＞A、c.919-2A＞G、c.678T＞C，致病性位点携带率为4.73%（19/402），占突变等位基因数26.03% （19/73）；检出率前三位分别是c.1983C＞A位点5例，c.1547dup位点5例，c.754T＞C位点4例，分别占总突变等位基因的6.85%，6.85%，5.48%；而常见的突变位点c.919-2A＞G仅2例；本研究还检出2个（2.74%）可能良性位点, 等位基因数2个（2.74%)：c.818C＞T、c.16G＞A；5个良性位点，等位基因数24个（32.88%）：c.69C＞A、c.2236-25T＞A、c.919-18T＞G、c.1707+76G＞C、c.1826T＞G；13个重要性不明确位点，等位基因数20个（27.40%）及7个新发现的突变位点，等位基因数8个（10.96%）。4类突变位点中致病性位点、良性突变位点和重要不明确位点所占比例接近，可能良性突变位点与新发现突变位点所占比例较少。33个突变位点中最常见的是c.69C＞A良性位点，等位基因数13个，占总突变等位基因数的17.81%，其他的突变等位基因位点所占比例均为6.85%及以下。见表2。

表2 402例孕期女性SLC26A4基因测序结果分析

2.4 GJB3和SLC26A4基因复合突变

402例壮族孕期女性中发现有21例携带GJB3和SLC26A4基因复合突变，携带率为5.22%。21例复合突变中共有18种基因型，携带有致病性位点的基因型有5例，分别为c.357C＞T/c.754T＞C、c.357C＞T/c.1905G＞A、c.357C＞T/c.1983C＞A，其他15种基因型未携带有致病性突变位点，但因是GJB3与SLC26A4复合突变，故其致病性未知。见表3。

表3 GJB3和SLC26A4基因复合突变结果分析

3 讨论

GJB3基因编码缝隙连接蛋白CX31，位于1p34号染色体上，有一个编码外显子，c.547G＞A和c.538C＞T位点位于该编码区上。目前在人类耳聋基因变体数据库记录的GJB3介导的常染色体隐性遗传非综合征性耳聋上的突变位点仅8个，本研究中未检出，c.547G＞A和c.538C＞T位点在该数据库中分类属于重要性不明确，本研究中分类为致病性位点。c.547G＞A和c.538C＞T位点突变早期被认为其可导致遗传性高频听力损失[6]，然而这两个位点的致病性一直存在争议[7-8]，目前为止并没有系统的耳聋基因系研究证明这两个位点突变与耳聋的相关性，更有报道GJB3基因c.538C＞T位点突变与听力损失无关[7]。早期在我国这两个位点被认为是致病的，然而国内大量的研究报道不管是在健康人群还是在听力障碍人群中GJB3基因c.538C＞T和c.547G＞A位点突变率均很低，在广西也并非耳聋基因突变位点，壮族人群中的c.547G＞A和c.538C＞T突变携带率极低。本研究中402例壮族孕期女性共检出9个突变位点，其中c.538C＞T和c.547G＞A位点突变各检出1例，GJB3致聋性突变发病率很低，并非本地区壮族孕期女性的耳聋基因突变热点。

SLC26A4基因编码一个跨膜分子蛋白，该蛋白在氯化物、碘化物、碳酸氢盐和甲酸盐的转运中发挥重要作用，SLC26A4致病性突变产物会导致该蛋白部分或完全失去活性从而引起Pendred综合征/非综合征性前庭导水管扩大（PDS/NSEVA）[3]。PDS/NSEVA以常染色体隐性遗传方式遗传，在SLC26A4双等位基因致病性变异的家族受孕时受累个体的每个同胞兄弟姐妹受累的发生率为25%，成为无症状携带者的几率为50%，未受累且不是携带者的发生率为25%[9]。当已知家族有SLC26A4致病性突变时，对高危家族成员进行携带者检测、对高危妊娠进行产前筛查和植入前基因诊断是很有必要的。SLC26A4基因突变具有高度异质性，在我国主要是c.919-2A＞G突变为主，其次为c.2168A＞G[10]；而日本韩国主要是c.2168A＞G为主[5，11]；欧美白人主要以c.1246A＞C、c.412G＞T、c.707T＞c为主[12]。考虑到SLC26A4基因突变不同区域种族遗传的异质性，本研究对402例壮族孕期女性进行SLC26A4全基因测序，旨在发现适合本地区的突变位点，增加本地区的突变谱。本研究结果提示，在402例壮族孕期女性中，SLC26A4基因常见的致病突变位点是c.1983C＞A位点5例，c.1547dup位点5例，c.754T＞C位点4例，c.1905G＞A位点2例，c.919-2A＞G位点2例和c.678T＞C位点1例，共6个位点19例，携带率为4.73%（19/402），而我国常见的突变位点c.919-2A＞G和c.2168A＞G在本地区并非突变位点。本研究中c.1983C＞A和c.1547dup位点已在我国的EVA患者中检出[13-14]；c.754T＞C突变位点的致病性已在EVA患者列队中有报道[10，15]，在我国新生儿携带率约0.14%[16]，本研究中检出率为1.00%，可能是本研究样本数有限；而检出率较低的c.1905G＞A和c.678T＞C位点在我国的EVA患者中已有报道[13]。本研究通过对SLC26A4进行基因测序发现，广西南宁市壮族孕期女性常见的突变位点为c.1983C＞A、c.1547dup、c.754T＞C、c.1905G＞A、c.919-2A＞G和c.678T＞C，与国内其他地区有显著差异，可能是其他地区未检测以上几个位点，也可能是本研究例数有限。

本 研 究 共 检 出21例GJB3与SLC26A4复合杂合突变，携带率为5.22%；其中有5例携带SLC26A4致病性突变位点，携带率为1.24%。两个基因复合突变对耳聋的致病作用有待进一步研究，在健康孕期女性中筛查出此类复合突变建议进行遗传咨询。

综上所述，南宁市壮族孕期女性携带GJB3突变较低，并非本地区壮族孕期女性的耳聋基因突变位点；南宁市壮族孕期女性SLC26A4突变较高，突变谱具有多样性，常见致病突变位点为c.1983C＞A、c.1547dup、c.754T＞C、c.1905G＞A、c.919-2A＞G和c.678T＞C；壮族孕期女性GJB3与SLC26A4复合杂合突变对耳聋的致病作用有待进一步研究。因此对南宁市壮族孕期女性进行耳聋基因检测时可增加筛查SLC26A4基因以上突变位点，指导优生优育。