刘 丹 许 静 李志平 何 皎 宫灿仪 韦 甫 夏笔军

南方医科大学皮肤病医院，广东广州 510095

壬二酸为9碳直链二元酸，别名杜鹃花酸。壬二酸为无色至淡黄色晶体或粉末，熔点98～103℃，微溶于冷水，溶于热水、乙醚，易溶于乙醇。壬二酸能直接抑制黑素细胞、抑制和杀灭细菌，具有抗炎、抑制细胞增殖等药理作用[1-2]。目前，壬二酸凝胶在治疗痤疮、黄褐斑、酒糟鼻、色素过度沉着等方面得到了广泛应用，该药安全性好，局部应用未见明显不良反应[3-4]，但起效剂量需大于10%（g/g）。由于壬二酸在水中的溶解度低，熔点高以及起效剂量大，易变色，使其应用受到很大限制。2003年国内药厂中康恩贝生产的20%壬二酸乳膏上市，但目前批准文号尚未转正，长期断货。目前，壬二酸临床上使用的剂型有乳膏、霜、软膏[5-9]。因壬二酸制剂的处方设计有一定难度，主要是高浓度壬二酸导致沙砾感或易引起破乳。在已报道的制剂中，壬二酸为不能完全溶解的细粉分散在基质中，这降低了壬二酸的生物利用度[10]。本研究发现加入非离子型增溶剂聚氧乙烯蓖麻油EL可改善壬二酸的溶解度，提高其在水中的溶解性。本研究研发了新型15%壬二酸凝胶外用制剂，壬二酸凝胶具有清爽、渗透性好、显效快、作用持久等优点。该凝胶剂无沙砾感，无分层和破乳，质量稳定可控，安全、有效。本研究探讨了一种加VIPER柱前管路高效液相色谱法直接测定壬二酸含量的方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

紫外分光光度仪（UV-2450，日本岛津），高效液相色谱仪（LC-20A，日本岛津），C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm，Aquasil，Thermo），VIPER柱前管路（Thermo），十万分之一电子天平（MS-105，梅特勒），光学显微镜（CX31，OLYMPUS），集菌仪（HTY-601型集菌仪，浙江泰林生物技术有限公司）。

1.2 试药

壬二酸凝胶（15%，批号：20190320、20190324、20190326，南方医科大学皮肤病制剂中心配制），壬二酸对照品（中国食品药品检定研究院，101067-200901）；超纯水，甲醇（Merck，色谱纯），其余试剂均为分析纯。

1.3 培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：181221），沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：190115），胰酪大豆胨液体培养基（批号：181119），沙氏葡萄糖液体培养基（批号：190126），甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号：180828），溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批号：180820），以上培养基均购于北京陆桥技术股份有限公司，经适用性检查均符合规定。

1.4 菌株

铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]，金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]，白色念珠菌（candida albicans）[CMCC（F）98001]，黑曲霉（aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）（ATCC6633）均购于广东省药品检验所。

2 处方与制备

2.1 处方

壬二酸150g，卡波姆940 12g，三乙醇胺12g，丙二醇120g，乙醇50g，聚氧乙烯蓖麻油EL 150g，EDTA-2Na 0.3g，纯化水465.7g，共制1000g。

2.2 制备

2.2.1 增溶剂选择的选择 比较增溶剂吐温80和聚氧乙烯蓖麻油EL的增溶效果，聚氧乙烯蓖麻油EL增溶效果优于吐温80。所以，确定增溶剂为聚氧乙烯蓖麻油EL。考察处方中聚氧乙烯蓖麻油EL 10%、12%、15%三种含量的增溶作用，15%的聚氧乙烯蓖麻油EL能使壬二酸在水中完全溶解。所以，确定增溶剂聚氧乙烯蓖麻油EL的浓度为15%。

2.2.2 制备方法 卡波姆940用50℃水分散浸泡24h得A液；取壬二酸加丙二醇润湿搅匀，加聚氧乙烯蓖麻油EL、EDTA-2Na、纯化水，水浴加热至65℃，加入乙醇得B液；将B液加入A液中，边加边搅拌，加三乙醇胺中和调节pH=6，搅拌至冷凝，即得。

3 质量控制研究

3.1 鉴别

液相色谱法，结果显示，供试品溶液与对照品溶液主峰的保留时间相符，见图1。

3.2 检查

3.2.1 粒度 参照《中华人民共和国药典》2015年版四部粒度和粒度分布测定法（通则0982第一法）测定[12]，均不得检出大于180μm的粒子。结果显示，粒子粒度均小于150μm。

3.2.2 微生物限度方法学验证与检查

3.2.2.1 微生物限度检查方法学验证 壬二酸凝胶微生物限度检查验证方法参照《中华人民共和国药典》2015版和本实验室的适用性实验方法[11-12]，各菌株回收率结果见表1，控制菌验证结果见表2。

表1 各菌株不同验证方法的回收率

由表1可见，取1∶20的供试液，用平皿法时，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3个菌株3次试验的回收率均在0.5～2.0范围内，因此本品的需氧菌总数可用平皿法检查（即1∶20的供试液，1mL/皿）。取1∶10的供试液，用平皿法时，白色念珠菌和黑曲霉2个菌株3次的回收率均在0.5～2.0，表明本品的霉菌和酵母菌总数可用平皿法检查（即1∶10供试液，1mL/皿）。

表2 控制菌验证结果

由表2可见，本品可用常规法检查金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。

3.2.2.2 微生物限度检查 供试液制备：取本品10g，先加少量5%（g/mL）聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，置45℃水浴使溶散，再加45℃含5%（g/mL）聚山梨酯80 pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，边加边摇，静置1min，取下层液作为1∶10的供试液。取1∶10的供试液适量，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成1∶20的供试液。

需氧菌总数取1∶20的供试液1mL，按平皿法检查。

霉菌和酵母菌总数取1∶10的供试液1mL，按平皿法检查。

金黄色葡萄球、菌铜绿假单胞菌取1∶10的供试液10mL，分别接种至不少于100mL胰酪大豆胨液体培养基中，按控制菌检查法试验。

3.2.2.3 微生物限度检查结果 三批壬二酸凝胶（批号：20190320、20190324、20190326）需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数为0，未检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。

3.3 壬二酸含量测定方法学验证与结果

3.3.1 色谱条件 色谱柱：Thermo AQUASIL C18柱（250mm×4.6mm，5μm），以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温：40℃。流动相：甲醇-水-磷酸（40∶60∶0.1），流速：1.0mL/min；检测波长：210nm；进样量：20μL。

3.3.2 溶液的制备

3.3.2.1 对照品溶液的制备 取壬二酸对照品，精密称定，加甲醇适量，超声使溶解，制成0.6mL/min的壬二酸对照品溶液。

3.3.2.2 供试品溶液的制备 精密称定壬二酸凝胶0.2g，加甲醇适量置50mL容量瓶中，超声使溶解，用甲醇定容，摇匀，冰浴1h，过滤，取续滤液，即得。

3.3.2.3 阴性对照液的制备 精密称定壬二酸凝胶的阴性样品0.2g，同“3.3.2.2”项方法制备阴性对照溶液。

3.3.3 方法学验证

3.3.3.1 专属性实验 取供试品溶液、对照品溶液及阴性对照溶液按“3.3.1”项色谱项条件项分别测定，记录色谱图，观察主要成分色谱峰的保留时间是否一致，各成分是否相互干扰。结果表明阴性样品无干扰，理论板数为10 885，分离度18.2，拖尾因子1.02，方法的专属性较好，见图1。

图1 三种溶液的HPLC图

3.3.3.2 回收率实验 取壬二酸对照品0.3g，精密称定，至50mL容量瓶中，加甲醇超声溶解制成浓度为6mL/min的对照品溶液，作为壬二酸对照品母液。取空白基质0.20g，精密称定，平行9份，分别精密加入对照品母液4、5、6mL，置50mL量瓶中，每个浓度各配制3份，同“3.3.2.2”项供试品溶液的制备方法制备，即得相当于标示量80%、100%、120%的样品，计算回收率，见表3。

结果显示，壬二酸平均回收率为99.4%，RSD为0.55%，说明该方法的准确度较好，符合定量测定要求。

3.3.3.3 定量限 精密称定壬二酸对照品0.02g，置20mL容量瓶中，加流动相溶解并定容（浓度为1.000mL/min）。取上述溶液加甲醇逐级稀释，测得壬二酸的定量限为0.525μg/mL（信噪比为10∶1）。

表3 回收率试验结果（n=9）

3.3.3.4 线性关系考察 取壬二酸对照品0.2g，精密称定，至20mL容量瓶中，加甲醇超声溶解成10.00mg/mL的对照品溶液，作为对照品母液。分别 精 密 量 取 对 照 品 母 液0.1、0.2、1.6、3.2、6.4mL至10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成0.100、0.200、1.600、3.200、6.400mg/mL壬 二 酸 对 照 品 溶液，按“3.3.1”项色谱条件测定，以峰面积为纵坐标Y，以浓度为横坐标X，进行线性回归，得线性方程：Y=556 068.6X-24 893.91，r=0.9999，壬二酸在0.100～6.400mg/mL范围内呈良好的线性关系。

3.3.3.5 精密度实验 精密吸取对照品溶液20μL，注入液相色谱仪，连续测定6次，记录壬二酸的峰面积，结果峰面积积分值的RSD为0.39%，表明精密度良好。

3.3.3.6 重复性实验 取壬二酸凝胶（批号：20180310）0.2g，精密称定，平行6份，按“3.3.2.2”供试品溶液制备项的方法制备，按照“3.3.1”项色谱条件进样，以峰面积计算壬二酸的含量，结果含量的平均值为15.4%（g/g），RSD为0.56%，表明本含量测定方法重复性良好。

3.3.3.7 稳定性实验 按照“3.3.2”溶液制备项制备供试品溶液和对照品溶液，按照“3.3.1”项色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24h进样，测定峰面积，计算含量，结果RSD为0.56%，表明供试品溶液在24h内稳定。

3.3.3.8 样品含量测定 取3批壬二酸凝胶（批号：20190320、20190324、20190326）各3份，每 批 平行测定3次，测定峰面积，按外标法计算壬二酸的含量，结果3批样品的含量分别为标示量的99.3%（RSD=0.48%）、100.2%（RSD=0.35%）、100.8%（RSD=0.52%）。

4 稳定性考察

4.1 离心试验[13]

取样品适量，装入离心管中，以4000r/min转速离心30min，结果显示壬二酸凝胶无破乳、无分层现象。

4.2 耐寒耐热试验[13]

取样品适量，分装于包装盒内加盖，分别置-15℃冰箱24h，置55℃干燥箱恒温6h，结果显示壬二酸凝胶无破乳、无分层现象。

4.3 加速试验

取3个批次样品，在温度为（30±2）℃，相对湿度为（65±5）%的条件下进行试验，放置6个月。于试验的第0、3、6个月末取样一次，考察壬二酸凝胶的性状、鉴别、检查、含量，结果显示样品的各项质量指标均符合质量标准。

4.4 长期试验

取3个批次样品，在温度为（25±2）℃，相对湿度为（60±10）%的条件下，放置12个月。于试验的第0、3、6、9、12个月末取样一次，考察壬二酸凝胶的性状、鉴别、检查、含量，结果显示样品的各项质量指标均符合质量标准。

5 讨论

由于壬二酸在水中的溶解度低，熔点高以及起效剂量大，易变色，使其在应用时受到很大限制。增溶剂聚氧乙烯蓖麻油EL，稳定性好，安全[14]。所以，选用聚氧乙烯蓖麻油EL作为增溶剂。考察并筛选出了溶解壬二酸的最佳温度65℃。壬二酸凝胶制备方法可行，稳定性良好。

壬二酸为直链二羧酸，臧亚茹[15]采用酸碱滴定法测定复方壬二酸乳膏中壬二酸的含量，有文献报道[16-17]采用HPLC法检测脂质体中壬二酸杂质，采用衍生化后HPLC法测定壬二酸的含量。本研究通过加VIPER柱前管路HPLC法直接测定壬二酸的含量，比较了不加柱前管路使用流动相甲醇-水-0.01mol/mL乙酸铵，甲醇-水-0.1%磷酸，色谱峰均前延，峰形不对称，加VIPER柱前管路，峰型对称，分离度＞1.5，所以通过加VIPER柱前管路测定含量。进一步比较不同流动相的理论塔板数，甲醇-水-0.1%磷酸的理论塔板数高于甲醇-水-0.01mol/mL乙酸铵。因此，确定流动相为甲醇-水-0.1%磷酸。

新剂型壬二酸凝胶质量稳定可控，制备和质量控制方法可行，重复性好，为开发壬二酸凝胶新制剂提供理论基础。