单晓英 张祥华 王 岩

山东省莒县中医医院儿科，山东莒县 276500

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一种恶性造血系统疾病，其特征在于骨髓祖细胞/前体分化受损和不受控制的克隆扩增，导致骨髓衰竭和正常造血功能受损[1]。AML是成人中最常见的急性白血病，也是儿童中第二常见的白血病。目前，AML的临床治疗仍以联合化疗为主，但其总体缓解率有限，复发率也偏高。尤其是老年AML患者，确诊后的生存期仅5～10个月[2]。肿瘤细胞的增殖与凋亡涉及到细胞基因组学的改变，其中，长链非编码RNA（long non-coding RNAs，LncRNAs）在此过程中发挥着重要作用。因LncRNAs可通过表观遗传学[3]、转录[4]以及转录后调控[5]介导基因的表达调控，近年来成为药物抗肿瘤作用机制研究的热点。其中，LncRNA-H19是最早报道的LncRNAs之一，其在大多数成体组织中不表达或低表达，然而，在脑、呼吸系统、消化系统、泌尿系统及生殖系统肿瘤中的表达均呈上升趋势，且其致癌作用机制因肿瘤不同而存在差异[6]。冬凌草是一种唇形科香茶菜属植物，产于贵州、四川、广西等地区，在传统上常用于清热解毒、消炎止痛、活血等。冬凌草富含贝壳杉烷二萜、三萜、甾体以及挥发油等成分，尤其是其主要活性成分冬凌草甲素在食管癌[7]、胃癌[8]、结直肠癌[9]、骨肉瘤[10]等恶性肿瘤中表现出良好的抗癌作用且无明显的毒副作用，因此引起了国内外研究者的广泛关注[11]。本研究旨在观察冬凌草甲素对HL-60细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其作用机制是否与调控LncRNA-H19相关。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂

人急性髓系白血病细胞HL-60购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；冬凌草甲素（纯度＞98%）购于北京环宇生物技术有限公司，用二甲基亚砜配制成10mmol/L母溶液；胎牛血清、RPMI-1640培养基购于美国Gibco公司；青霉素、链霉素、Lipofectamine 2000、Trizol、RT-PCR试剂盒购于美国Invitrogen公司；CCK-8细胞增殖检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购于美国BD公司；碘化丙锭染料购于美国Sigma公司；兔抗人Caspase-3、兔抗人Bax、兔抗人Bcl-2、兔抗人LC3-Ⅱ、兔抗人Beclin-1单克隆抗体购于美国Cell Signaling公司。

1.2 主要仪器

Real time PCR分析仪购于美国ABI公司；流式细胞仪购自美国Backman公司；电泳仪购于美国Bio-Rad公司。

1.3 细胞培养

HL-60细胞在RPMI-1640培养基中常规培养（含10%胎牛血清、1%青霉素、1%链霉素），培养条件为5%CO2、37℃、饱和湿度。取对数生长期细胞进行实验。

1.4 细胞转染

采用Lipofectmine 2000将阴性对照（si-NC组）和LncRNA-H19 siRNA（si-LncRNA-H19组）转染至HL-60细胞，转染6h后换新鲜的RPMI-1640培养基继续培养细胞，直至48h收取细胞，提取RNA检测LncRNA-H19表达情况。

1.5 LncRNA-H19表达检测

采用Trizol试剂提取细胞中的总RNA并逆转录合成cDNA，用cDNA作为模板合成扩增目的基因，采用β-actin作为内参照基因。反应条件为95℃预变性30s，95℃变性15s，60℃退火35s，共40个循环。LncRNA-H19基因的上游引物序列为：5'-CTACAGCTTACTTCAAGGCCAG-3'；下 游 引 物序列为5'-TCAGAGACAGTCAAGCGGTAT-3'。

1.6 细胞增殖检测

采用CCK-8法检测HL-60细胞增殖情况，收集处于对数生长期的HL-60细胞并接种于96孔板上，密度为5×103个细胞/孔。先以溶媒二甲基亚砜作为对照（Control）组，观察不同浓度冬凌草甲素（5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μmol/L）对HL-60细胞增殖的影响；在细胞转染成功后，用25μmol/L冬凌草甲素处理si-NC组和si-LncRNA-H19组细胞，观察LncRNA-H19 siRNA对HL-60细胞增殖的影响。培养48h后，每孔加入10μL的CCK8溶液，于37℃持续孵育2h，再用酶标仪在450nm处检测吸光度。实验重复3次。

1.7 细胞凋亡检测

采用流式细胞术法检测HL-60细胞的凋亡情况，收集处于对数生长期的HL-60细胞并接种于6孔板上，密度为5×105个细胞/孔。先以溶媒二甲基亚砜作为对照（Control）组，观察不同浓度冬凌草甲素（5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μmol/L）对HL-60细胞凋亡的影响；在细胞转染成功后，用25μmol/L冬凌草甲素处理si-NC组和si-LncRNA-H19组细胞，观察LncRNA-H19 siRNA对HL-60细胞凋亡的影响。培养24h后收集细胞，以1500rpm离心5min，弃上清液，用PBS漂洗3次，弃上清液。再将细胞重悬浮并分别加入10μL的Annexin V-FITC和5μL的碘化丙锭染料，混匀，于25℃避光反应15min，再加入300μL缓冲液于1h内采用流式细胞仪检测。

1.8 相关蛋白表达检测

采用Western Blot法检测相关蛋白表达水平。收集处于对数生长期的HL-60细胞并接种于6孔板上，密度为5×105个细胞/孔。先以溶媒二甲基亚砜作为对照（Control）组，观察不同浓度冬凌草甲素（5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μmol/L）对HL-60细胞中相关蛋白表达的影响；在细胞转染成功后，用25μmol/L冬 凌 草 甲 素 处 理si-NC组和si-LncRNA-H19组细胞，观察LncRNA-H19 siRNA对HL-60细胞中相关蛋白表达的影响。培养24h后收集细胞，用RIPA裂解液处理细胞并采用BCA法定量总蛋白浓度。以每孔30μg上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳后转PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭液于25℃封闭1h后分别加入 兔 抗 人Caspase-3（1∶1000）、兔 抗 人Bax（1∶1000）、兔抗人Bcl-2（1∶1000）、兔抗人LC3-Ⅱ（1∶1000）、兔抗人Beclin-1（1∶2000）单克隆抗体，于4℃孵育过夜。用TBST漂洗3次后，加入辣根过氧化物标记的山羊抗兔IgG（1∶1000），于37℃孵育30min，用ECL发光剂显影。采用Quantity One软件分析条带灰度值，选择β-actin作为上样内参。目的蛋白相对表达水平=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

1.9 统计学分析

采用SPSS21.0统计学软件处理数据，计量资料以（）表示，多组间比较采用One-Way ANOVA分析，两组独立样本比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冬凌草甲素对HL-60细胞增殖和凋亡的影响

在5.0～25.0μmol/L浓度范围内，HL-60细胞存活率随着冬凌草甲素浓度的增加而降低，凋亡率随着冬凌草甲素浓度的增加而升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 冬凌草甲素对HL-60细胞增殖和凋亡的影响（%）

2.2 冬凌草甲素对HL-60细胞中凋亡和自噬相关蛋白表达的影响

在5.0～25.0μmol/L浓度范围内，冬凌草甲素呈浓度依赖性地促进Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达，抑制Bcl-2蛋白表达，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 冬凌草甲素对HL-60细胞中凋亡和自噬相关蛋白表达的影响（±s）

表2 冬凌草甲素对HL-60细胞中凋亡和自噬相关蛋白表达的影响（±s）

浓度（μmol/L） n Caspase-3 Bcl-2 Bax LC3-Ⅱ Beclin-1 0（Control） 4 0.70±0.05 0.86±0.05 0.69±0.06 0.60±0.07 0.65±0.06 5.0 4 0.85±0.07 0.71±0.06 0.85±0.07 0.76±0.08 0.85±0.09 10.0 4 0.91±0.11 0.66±0.07 0.92±0.07 0.87±0.09 0.94±0.10 15.0 4 1.04±0.14 0.63±0.07 1.01±0.11 0.92±0.10 0.98±0.12 20.0 4 1.13±0.13 0.60±0.08 1.12±0.09 0.97±0.12 1.13±0.14 25.0 4 1.14±0.15 0.53±0.06 1.42±0.15 1.15±0.14 1.17±0.13 F 6.791 9.532 20.711 9.897 8.977 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 冬凌草甲素对HL-60细胞中LncRNA-H19表达的影响

在5.0～25.0μmol/L浓度范围内，HL-60细胞中LncRNA-H19 mRNA表达量随着冬凌草甲素浓度的增加而降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表3。

表3 冬凌草甲素对HL-60细胞中LncRNA-H19表达的影响（±s）

表3 冬凌草甲素对HL-60细胞中LncRNA-H19表达的影响（±s）

浓度（μmol/L） n LncRNA-H19表达0（Control） 4 0.98±0.02 5.0 4 0.92±0.03 10.0 4 0.89±0.04 15.0 4 0.82±0.04 20.0 4 0.68±0.04 25.0 4 0.58±0.04 F 56.131 P＜0.01

2.4 沉默LncRNA-H19表达对冬凌草甲素诱导的HL-60细胞增殖和凋亡的影响

与si-NC组 比 较，si-LncRNA-H19组HL-60细胞存活率明显降低，细胞凋亡率明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 沉默LncRNA-H19表达对冬凌草甲素诱导的HL-60细胞增殖和凋亡的影响（± s，%）

表4 沉默LncRNA-H19表达对冬凌草甲素诱导的HL-60细胞增殖和凋亡的影响（± s，%）

组别 n 存活率 凋亡率si-NC组 4 46.61±4.25 14.21±1.23 si-LncRNA-H19组 4 37.50±4.04 17.15±1.66 t 2.689 2.462 P 0.036 0.049

2.5 沉默LncRNA-H19表达对冬凌草甲素诱导的凋亡和自噬相关蛋白表达的影响

与si-NC组 比 较，si-LncRNA-H19组HL-60细胞中Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 沉默LncRNA-H19表达对冬凌草甲素诱导的凋亡和自噬相关蛋白表达的影响（±s）

表5 沉默LncRNA-H19表达对冬凌草甲素诱导的凋亡和自噬相关蛋白表达的影响（±s）

组别 n Caspase-3 Bcl-2 Bax LC3-Ⅱ Beclin-1 si-NC组 4 1.11±0.13 0.57±0.07 1.41±0.11 1.12±0.11 1.19±0.13 si-LncRNA-H19组 4 1.40±0.14 0.42±0.08 1.67±0.11 1.35±0.10 1.43±0.11 t 2.629 2.528 2.713 2.485 2.622 P 0.039 0.045 0.035 0.047 0.039

3 讨论

现代动物和细胞实验表明，中药提取物在恶性肿瘤的防治中具有许多优势，如多靶点作用、副作用少等。冬凌草甲素是一种二萜类化合物，大量的研究表明冬凌草甲素通过诱导细胞周期阻滞、诱发代谢失衡、调控细胞通路等途径而抑制恶性肿瘤进展[12-14]。早在2004年，Liu等[15]报道，冬凌草甲素通过降低端粒酶活性，呈时间和浓度依赖性地抑制HL-60细胞生长，并显著诱导细胞凋亡。此后，Weng等[16]通过研究证实冬凌草甲素通过抑制miRNA-17和miRNA-20a启 动HL-60细 胞 凋亡程序。Li等[17]通过研究发现，冬凌草甲素联合丙戊酸协同抑制HL-60细胞增殖，通过激活内源性凋亡途径诱导Caspase依赖性凋亡，并引起细胞中Bcl-2/Bax比例下调。本研究通过CCK-8法以及流式细胞术发现不同浓度的冬凌草甲素对HL-60细胞增殖均有一定的抑制作用，并能有效诱导HL-60细胞凋亡，再次证实了冬凌草甲素在急性髓系白血病中具有明显的抗肿瘤作用。

Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡执行分子，其在接受上游Caspase分子信号后而被激活，通过裂解细胞浆、细胞核底物引起细胞凋亡，与凋亡中的染色质凝集、核固缩以及核碎裂等形态学变化密切相关[18]。Bcl-2家族是另一类调控细胞凋亡的重要分子，其中，抗凋亡成员Bcl-2和促凋亡成员Bax是国内外研究者引用最多的两个凋亡指标。然而，Bcl-2家族中促凋亡和抗凋亡成员之间比例的异常升高，可导致线粒体外膜通透性增加，刺激膜间隙蛋白释放，并激活其下游的Caspases级联反应，从而启动细胞凋亡程序[19]。将冬凌草甲素作用于HL-60细胞后，细胞中的Caspase-3和Bax蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达减少，因此，可推测冬凌草甲素诱导HL-60细胞凋亡可能与其调控细胞内Caspase-3、Bax和Bcl-2的表达，激活线粒体凋亡途径相关。

自噬是真核细胞内广泛存在的高度保守的生命现象，是细胞在饥饿、缺氧等应激环境中通过自我分解变形、受损或丧失功能的蛋白质和细胞器以维持细胞基因组稳定以及内环境稳态的一种方式，它既是细胞的自我保护机制，也是细胞的程序性死亡机制[20]。LC3-Ⅱ和Beclin-1是应用最多的自噬标志物。LC3-Ⅱ定位于自噬前体和自噬体，可被水解酶水解，其表达水平与自噬体数量成正比，并可反映自噬活性[21]。Beclin-1是自噬基因Ata6的同源基因，介导自噬蛋白定位于自噬泡并促进自噬体的形成与成熟，被视为自噬的直接执行者[22]。Yao等[12]通过LC3-Ⅱ检测和透射电子显微镜分析发现，冬凌草甲素通过抑制p53突变，干扰结直肠癌细胞中的葡萄糖代谢而诱导细胞自噬。叶利洪等[23]报道，冬凌草甲素可诱导人前列腺癌PC-3细胞中自噬相关蛋白Beclin-1表达。在纤维肉瘤中，冬凌草甲素通过诱导诱导内源性NO的生成，激活NO-ERKp53信号通路，从而介导肉瘤细胞的自噬，发挥抗肿瘤作用[24]。在本研究中，采用不同浓度的冬凌草甲素处理HL-60细胞后，细胞中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达水平均明显升高，表明冬凌草甲素可促进HL-60细胞自噬的增加。

LncRNA是一类由RNA聚合酶Ⅱ转录的长度大于200个核苷酸的RNA分子，无明显的开放阅读框且几乎无编码蛋白功能。近年来，随着高通量转录组测序等技术的发展，越来越多的LncRNA被确证为急性髓系白血病的诊断、预后分子靶标，其中，LncRNA-H19是研究热点之一。王彩霞等[25]通过MTT染色法以及流式细胞术初期确定LncRNA-H19具有调控急性髓系白血病细胞增殖和凋亡功能。Zhao等[26]通 过 研 究 发 现，LncRNA-H19在 急 性髓系白血病患者骨髓中异常高表达，而LncRNAH19可通过竞争性结合has-miRNA-19a和hasmiRNA-19调控细胞中DNA结合抑制剂2表达而促进细胞增殖。在本研究中，HL-60细胞经不同浓度的冬凌草甲素处理后，细胞中的LncRNA-H19 mRNA表达均明显明显降低，说明冬凌草甲素对HL-60细胞中的LncRNA-H19表达具有抑制作用。再进一步采用siRNA技术沉默LncRNA-H19的表达后，HL-60细胞细胞增殖率显著降低，凋亡率显著增加，Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达显著上调，Bcl-2的表达显著下调，提示LncRNA-H19低表达与冬凌草甲素具有协同抑制HL-60细胞增殖，促进HL-60细胞凋亡和自噬作用。

总而言之，本研究首次证实了冬凌草甲素通过抑制HL-60细胞中LncRNA-H19的表达而增加细胞中Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达，减少细胞中Bcl-2的表达，进而发挥抑制细胞增殖,促细胞凋亡、自噬作用。