孙石柱 王璐璐 姚立杰 张善强 王 冠 李永涛 刘丹阳 沈 雷

齐齐哈尔医学院基础医学院解剖学教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006

糖尿病及其并发症已经成为影响社会发展进步的重要慢性疾病[1]。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）适合糖尿病等造成的多种组织损伤的修复，是公认的细胞治疗领域首选细胞[2]。研究发现，高血糖环境导致MSCs活性降低[3]。脂肪中存在的脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，AdMSCs）具有容易获取等特征[4]。如果在高糖环境下促进hAdMSCs增殖或迁移能力的提高，将有利于hAdMSCs在再生医学的应用。

B淋巴细胞化学引诱物-1（B-lymphocyte chemical attractants-1，BCA-1）对肿瘤细胞具有很好的促进增殖作用，还具有抗免疫、招募肿瘤细胞归巢的效果[5]。研究发现，MSCs具有很低的免疫原性，并能逃避宿主免疫系统监视[6]，BCA-1可能对MSCs也发挥逃避免疫的作用。研究发现BCA-1可以促进MSCs分化为成骨细胞[7]，说明MSCs表面有BCA-1的相应受体。虽然缺氧环境下BCA-1能够促进人骨髓间充质干细胞的增殖或自噬[8]，但是在高糖环境下的相关研究还鲜见报道。

本实验在细胞高糖模型下，观察BCA-1刺激的hAdMSCs增殖和迁移的情况，并揭示其作用的分子机制，为hAdMSCs在组织工程或再生医学的进一步应用奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 一般材料

人脂肪间充质干细胞（广州赛业生物科技有限公司）；人BCA-1重组蛋白和人VEGF蛋白ELISA试 剂 盒（美 国R&D公 司）；PD98059（Cell Signaling公司）；细胞增殖试剂盒（CCK8，日本同仁公司）；α-MEM培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，美国Thermo Fisher公司）；多聚甲醛、结晶紫和葡萄糖（上海生工公司）；青-链霉素、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、RIPA细胞裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物科技公司）；小鼠抗人PI3K抗体、小鼠抗人MAPK抗体、小鼠抗人GAPDH抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗小鼠IgG（英国Abcam公司）。Bio-Rad 550酶标仪（Bio-Rad公司）；BX50型显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和细胞高糖模型 含10%FBS，1μmol/L青霉素和100U/mL链霉素的α-MEM培养基培养hAdMSCs者为hAdMSC基础培养基。hAdMSC基础培养基中含30mmol/L葡萄糖则为hAdMSC高糖培养基。以此培养细胞则为细胞高糖模型[9]。

1.2.2 实验分组 细胞高糖模型下：培养的hAdMSCs为高糖对照组，50μmol/L浓度BCA-1刺激hAdMSCs为高糖BCA-1组，若在hAdMSCs中预先用含100nmol/L的PD98059培养30min，然后再添加50μmol/L BCA-1，则为高糖Erk抑制剂组，正常环境下培养的hAdMSCs为正常对照组。

1.2.3 CCK8实验 按上述hAdMSCs分组情况，将0.9×104/孔 hAdMSCs接 种 于96孔 板，100μL的hAdMSCs高糖培养基培养48h，每孔加入10μL CCK8，37℃，5%CO2培 养4h，使 用Bio-Rad 550酶标仪，在450nm波长测定样品吸光度值（absorbance value，A值）。

1.2.4 Transwell细胞迁移实验 1×104/室hAdMSCs置于Transwell细胞小室内，下层腔室按照实验分组添加不同试剂或无血清培养基，37℃，5%CO2培养12h后，收集下室液体，800s/min离心5min，收集细胞，并计数穿过细胞小室的hAdMSCs数目（计为a）；擦 除Transwell细 胞 小 室 内hAdMSCs，4%多聚甲醛溶液固定，0.5%结晶紫染色，Image-Pro Plus 6.0.1软件计算hAdMSCs被结晶紫染色的细胞数目（计为b）。计算hAdMSC迁移率=[（a+b）/1×104]×100%[10]。

1.2.5 ELISA 4.5×106各组hAdMSCs，按照hAdMSC分组情况，37℃，5%CO2，以含1% FBS的hAdMSC高糖培养基继续培养24h，收集各组hAdMSCs细胞上清液，人VEGF-ELISA试剂盒检测VEGF含量。

1.2.6 Western blot实验 按照hAdMSCs分组情况，培养每组5.5×106hAdMSCs，加入RIPA细胞裂解液及1mmol/L PMSF，4℃，12000r/min，离心5min；BCA法测定蛋白浓度。40μg各组蛋白样品，100V电泳90min；300mA转至硝酸纤维素薄膜40min；封闭液中封闭60min；添加小鼠抗人PI3K抗体（1∶550）、小鼠抗人MAPK抗体（1∶700）、小鼠抗人GAPDH抗体（1∶900）；4℃孵育12h，使用HRP标记山羊抗小鼠IgG（1∶350），室温孵育60min；洗膜后，增强化学发光剂（enhanced chemiluminescent agent，ECL）等步骤检测蛋白表达条带，Image-Pro Plus 6.0.1软件分析各蛋白条带的相对表达量[11]。

1.3 统计学分析

实验数据采用SPSS 21.0统计学软件进行统计分析。计量资料以（）表示，组间比较进行方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BCA-1促进hAdMSCs增殖

高糖对照组hAdMSCs的A值是正常对照组的0.59倍；相对于高糖对照组，高糖BCA-1组hAdMSCs增殖A值升高1.52倍，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；高糖Erk抑制剂组hAdMSCs的A值是高糖BCA-1组的0.71倍，差异有高度统计学意义（P＜0.01），见图1。

图1 CCK-8法检测BCA-1对hAdMSCs增殖的A值

2.2 BCA-1促进hAdMSCs迁移

高糖对照组hAdMSCs迁移率是正常对照组的0.35倍；高糖BCA-1组hAdMSCs迁移率是高糖对照组的1.78倍，差异有统计学意义（P＜0.01）；高糖Erk抑制剂组hAdMSCs迁移率是高糖BCA-1组0.79倍，差异有高度统计学意义（P＜0.01），见图2。

图2 Transwell细胞迁移实验检测BCA-1对hAdMSCs迁移的影响

2.3 BCA-1促进hAdMSCs中PI3K、MAPK蛋白表达

细胞高糖条件下，各组hAdMSCs的PI3K、MAPK蛋白相对表达量的组间比较差异均有高度统计学意义（P＜0.01）；高糖Erk抑制剂组hAdMSCs的PI3K蛋白和MAPK相对表达量分别是BCA-1组的0.49倍和0.46倍，差异有高度统计学意义（P＜0.01），见图3。

图3 Western blot检测BCA-1对hAdMSC的PI3K、MAPK蛋白表达的影响

2.4 BCA-1促进hAdMSCs表达VEGF蛋白

高糖对照组VEGF蛋白是正常对照组的1.87倍，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。高糖BCA-1组VEGF蛋白是高糖对照组的2.51倍，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；高糖Erk抑制剂组VEGF蛋白含量是高糖BCA-1组hAdMSCs的0.35倍，差异有高度统计学意义（P＜0.01），见表1。

3 讨论

脂肪组织是分布于人体比较广泛的结缔组织。研究发现，脂肪组织含有多分化性能，参与组织再生修复能力的细胞为脂肪间充质干细胞（human adipose-derived mesenchymal stem cells，hAdMSCs）。hAdMSCs获得比较容易，含量丰富，在骨和软骨、心血管损伤修复等领域起到“种子细胞”的作用[4]。高血糖会抑制宿主细胞生物活性，导致MSCs等细胞出现低增殖、迁移能力下降、能量代谢障碍等问题，不利于组织再生修复。如果在高糖环境下提高MSCs增殖或归巢等能力，将对保护MSCs，移植MSCs发挥组织再生功能形成新策略。

表1 BCA-1促进hAdMSCs表达VEGF蛋白（±s，pg/mL，n=24）

表1 BCA-1促进hAdMSCs表达VEGF蛋白（±s，pg/mL，n=24）

注：与正常对照组比较，##P＜0.01；与高糖对照组比较，#P＜0.01；与高糖BCA-1组比较，*P＜0.01

指标 正常对照组 高糖对照组 高糖BCA-1组 高糖Erk抑制剂组VEGF 0.33±0.19 0.62±0.10## 1.57±0.64# 0.61±0.42*

趋化因子是具有调节细胞增殖、分化、促进细胞归巢能力的肽类家族[12]。B淋巴细胞化学引诱物（BCA-1）与基质细胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）的分子结构类似，同属于趋化因子家族中的CXC亚科[13]。BCA-1具有炎症介质作用，又称为趋化因子13（CXCL-13），BCA-1与细胞表面趋化因子受体5（CXCR5）结合，除了对损伤组织周围MSCs等细胞具有招募作用外，还能促进MSCs等干细胞旁分泌VEGF等因子，在伤口愈合中有重要意义[14]。

本实验在细胞水平发现，高糖对照组hAdMSCs增殖A值低于正常对照组，这是由于高浓度葡萄糖会干扰线粒体能量合成或释放，细胞内产生大量活性氧等氧自由基，多余的氧自由基则会干扰细胞内呼吸链，形成恶性循环而导致细胞增殖能力降低[15]。添加50μmol/L的BCA-1后，hAdMSCs增殖A值升高，提示BCA-1可促进细胞增殖，对维持细胞抗高糖性损伤具有积极意义。报道发现，BCA-1能 促 进MSCs成 骨 分 化[16]，说 明MSCs膜上有BCA-1的相应受体。因此，本实验没有利用PCR等实验技术观察MSCs表面的BCA-1受体，但是通过BCA-1促进细胞增殖能力的提高，提示BCA-1能够结合hAdMSCs表面的相应受体。

临床观察到慢性关节炎的关节囊滑膜层结缔组织中会显著表达BCA-1蛋白，并发现在高表达的BCA-1周围，白细胞、巨噬细胞等细胞集中分布，说明BCA-1能够招募白细胞、巨噬细胞等免疫性细胞归巢和增殖，造成局部炎症反应[17]。本实验也发现，50μmol/L BCA-1均会导致hAdMSCs迁移率增加，随着BCA-1浓度的增加，hAdMSCs迁移率逐渐升高，说明BCA-1作用于hAdMSCs表面的受体，不仅能促进hAdMSCs分化或增殖，更能够招募hAdMSCs归巢。这与乳腺癌等恶性肿瘤细胞较快生长，易造成局部形成乏氧环境。乏氧环境的肿瘤细胞分泌BCA-1不仅能发挥抑制宿主免疫监视、逃避免疫的作用，更能促进肿瘤细胞增生、迁移的研究结果相一致[18]。BCA-1抑制宿主免疫监视，招募hAdMSCs归巢到肿瘤组织，hAdMSCs是否受到肿瘤微环境的影响分化为血管内皮细胞或肿瘤干细胞，促进肿瘤发生或转移[19]，还需要深入探索。

糖尿病患者的高血糖环境会导致小血管、线粒体病变，形成细胞或组织乏氧状态。本实验发现在高糖条件下BCA-1组hAdMSCs增殖活性提高的现象与学者在肿瘤细胞、炎症细胞的研究结果基本一致[19]。添加了Erk抑制剂的各组hAdMSCs增殖能力相应降低，提示细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinases，Erk）信号通路可能在BCA-1对hAdMSCs的作用中起到一定作用。PD98059抑制了Erk蛋白后，hAdMSCs细胞增殖能力降低，同时下游MAPK蛋白表达明显降低，这可能是由于BCA-1结合在hAdMSCs表面的CXCR5受体，激活了PI3K蛋白激酶，上调Erk激酶，再活化下游的MAPK蛋白，最后启动VEGF蛋白的分泌。VEGF能够反作用于hAdMSCs，促使细胞抵抗高糖损伤，维护细胞生物活性[20]。研究表明，BCA-1能激活Erk通路，促进乳腺癌MCF-7细胞移植的小鼠肿瘤模型的肿瘤体积增大，乳腺癌细胞增殖和血管新生，加速肿瘤的血管转移[21]。本研究也不排除BCA-1可能还具有激活NF-κB诱导激酶（NF-κB induced kinase，NIK）信号通路等作用[22]，与BCA-1有关的相关分子机制还需要借助分子生物学、动物模型等实验进行深入验证。

综上所述，在高糖环境中，BCA-1结合hAdMSCs表面受体，激活细胞内PI3K-Erk-MAPK信号通路，促进hAdMSCs旁分泌VEGF蛋白，发挥了保护hAdMSCs抗高糖损伤的效果。