胡海珍，朱国萍，李小宁△

1.皖南医学院弋矶山医院检验科，安徽芜湖 241000；2.安徽师范大学，安徽芜湖 241000

肺炎克雷伯菌属于肠杆菌科中的克雷伯菌属，该菌广泛存在于自然界中，是一种常见的条件致病菌。肺炎克雷伯菌易对药物产生耐药性，且耐药率在升高，其耐药机制比较复杂。随着抗菌药物的广泛使用，容易造成体内菌群失调，引发肺部炎症、肝脓肿、泌尿系统感染等疾病[1-2]，已经出现了多重耐药、广泛耐药的肺炎克雷伯菌感染，给临床抗感染治疗带来挑战。

整合子是常见的可移动遗传元件，具有捕获并整合外来基因盒的新型DNA元件，是一种天然复制的表达载体，具备基因盒的遗传结构及位点重组系统，通过对外来基因进行切除和整合，从而获取耐药基因，同时，在上游的启动子作用下使其表达[3-4]。它通过获取耐药基因盒的方式，使自身的位点特异性基因重组，将多种耐药基因组装在一起造成耐药基因扩散，使细菌具有耐药性，甚至是多重耐药性[5]。随着越来越多的新药研发，抗菌药物的广泛使用，细菌耐药基因盒的类型逐渐增多，最终导致更多复杂的耐药菌出现[6]。因此，从分子机制上研究整合子-基因盒介导耐药形成的原因，显得尤为重要。本研究拟采用PCR扩增技术检测芜湖地区整合子-基因盒在肺炎克雷伯菌中的分布情况，分析肺炎克雷伯菌菌株中含有的耐药基因盒，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料

1.1.1菌株收集 收集2018年6月至2019年8月105株经Vitek2全自动细菌鉴定仪鉴定为肺炎克雷伯菌菌株的分离株，均来自皖南医学院弋矶山医院，编号依次为1～105。按照《全国临床检验操作规程》第4版[7]操作流程对细菌进行分离培养。

1.1.2药敏试验 采用Vitek2全自动微生物分析鉴定仪对105株肺炎克雷伯菌分离株进行细菌再次鉴定及药敏试验，对药敏试验结果进行初步筛查。多重耐药菌株的判断标准：对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、喹诺酮类中的3类或3类以上耐药的菌株，即为多重耐药菌株。产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的肺炎克雷伯菌的判断标准：ESBLs可以水解灭活青霉素类、头孢菌素类；一般对青霉素类抗菌药物及碳青霉烯类抗菌药物无水解作用；活性可被舒巴坦、克拉维酸等复合制剂所抑制。耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)的判断标准：对碳青霉烯类抗菌药物(如亚胺培南、美罗培南等)耐药的菌株。

1.2仪器与试剂 引物序列根据参考文献[8]由安徽通用生物有限公司设计合成，见表1。琼脂糖凝胶购自安徽通用生物有限公司，PCR仪购自美国ABI公司，电泳仪购自北京六一仪器厂，凝胶成像系统购自美国Biorad公司，Vitek2微生物鉴定分析仪购自法国Biomerieux公司。

1.3方法

1.3.1模板制备 将收集的菌种用三区划线法接种在血平板上，放入培养箱中37 ℃培养 24 h；用灭菌过的接种针蘸取单个菌落后，将其接种于盛有肉汤的EP管中，随后放入37 ℃摇床中增菌后待用。

表1 引物序列及产物长度

1.3.2整合子检测 PCR反应体系共 20.0 μL：DNA 模板 1.0 μL，引物(整合酶Ⅰ、整合酶Ⅱ或整合酶Ⅲ)0.8 μL,绿酶(M7822 GoTaq G2 Green Master Mix)10.0 μL，灭菌水8.2 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，60、54、52 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，34个循环；72 ℃延伸10 min。1%琼脂凝胶：用电子天平称取0.6 g琼脂糖加入烧瓶，往烧瓶中加入60 mL 1×TAE，用微波炉进行多次短时间加热，至琼脂糖溶解且看不见任何絮状物后，过凉水冷却至55 ℃，加入6.0 μL EB摇晃至均匀后，缓慢倒入洁净的模具中，倾倒过程中应避免气泡的产生，放置室温中冷却至凝固定型，待琼脂凝固后可拔出梳子，备用。PCR产物各取5.0 μL进行点样并记录位置，设电伏120 V，电泳30 min，电泳结束后，使用凝胶成像仪检测。

1.3.3基因盒的检测 PCR反应体系共50.0 μL：DNA模板4.0 μL，引物(整合子可变区)4.0 μL，绿酶(M7822 GoTaq G2 Green Master Mix)18.0 μL，灭菌水24.0 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性4 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸5 min，34个循环；72 ℃延伸10 min。1%琼脂凝胶：同1.3.2。PCR产物各取5.0 μL进行点样并记录位置，设电伏120 V，电泳30 min，电泳结束后，使用凝胶成像仪检测。

1.3.4扩增产物的测序及分析 PCR扩增产物送安徽通用生物有限公司测序。采用BLAST比对分析测序结果。

1.4统计学处理 统计分析采用Graphpad Prism 6.0统计学软件，计数资料以率表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1药敏试验 105株肺炎克雷伯菌分离株依据耐药性分类：非多重耐药肺炎克雷伯菌有52株(49.5%)；多重耐药肺炎克雷伯菌有53株(50.5%)，包括仅产ESBLs的肺炎克雷伯菌有35株，同时产ESBLs和CRKP肺炎克雷伯菌有18株。

2.2整合子检测结果 在105株肺炎克雷伯菌分离株中，检出Ⅰ类整合子61株(部分检测结果见图1)，检出率为58.1%(61/105)，未检出Ⅱ类和Ⅲ类整合子菌株。61株中有18株是同时产ESBLs和CRKP肺炎克雷伯菌,有20株是仅产ESBLs的肺炎克雷伯菌,有23株是非多重耐药肺炎克雷伯菌。多重耐药肺炎克雷伯菌的Ⅰ类整合子的检出率(71.7%，38/53)明显高于非多重耐药肺炎克雷伯菌(44.2%，23/52)，差异有统计学意义(P=0.004 3)。

2.3可变区基因盒测序结果 含有Ⅰ类整合酶的61株菌中，可变区的PCR扩展后凝胶电泳并通过凝胶成像系统显像，其中有39株可见亮条带，22株未见条带。39株亮条带中，非多重耐药肺炎克雷伯菌有3株，仅产ESBLs的肺炎克雷伯菌有18株，同时产ESBLs和CRKP的肺炎克雷伯菌有18株。22株未见条带中20株为非多重耐药肺炎克雷伯菌，2株为产ESBLs的肺炎克雷伯菌。将39株PCR产物送至安徽通用生物有限公司测序，经BLAST比对，有27株的基因序列比对出耐药基因(27株菌株均对喹诺酮类耐药，却未检出相应的耐药基因盒qnrVc1，其中有13株菌株对亚胺培南耐药，却未检出相应的耐药基因盒blaKPC)，12株未比对出耐药基因。共比对出5种耐药基因：氨基糖苷类aadAl、aacA4、aadA2和磺胺类dfrA1、dfrA12。该39株耐药表型及比对出的耐药基因盒组合情况见表2。

注：M表示DNA Marker，阴表示阴性对照，22、23、25、26、29、31、32、33、34、35、38、39、40为扩增结果阳性条带。

表2 39株可变区阳性条带的肺炎克雷伯菌检测结果

续表2 39株可变区阳性条带的肺炎克雷伯菌检测结果

3 讨 论

肺炎克雷伯菌引发肺炎、肝脓肿、泌尿系统等感染性疾病日益增多，非多重耐药肺炎克雷伯菌引起的感染，给临床抗感染治疗带来巨大挑战。研究肺炎克雷伯菌的耐药机制，对于临床医生及时选择有效的抗菌药物起到很大的指导作用。目前，碳青霉烯类抗菌药物是治疗临床上多重耐药菌感染患者常用且有效的药物。随着此类药物的大范围不规范应用，导致耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌不断增多，尤其是CRKP。根据我国监测报告，CRKP菌株的检出率呈逐年上升趋势，亚胺培南和美罗培南的耐药率由2015 年的 15.6%和14.4%，上升至2017年的20.9%和24.0%[9-10]。

整合子是一类可以通过位点特异性重组方式捕获、剪切、整合外源性耐药基因的DNA元件，其被认为是导致抗菌药物抗性、毒性和致病性产生及扩散的移动元件[11]。其基本组成包括5′-保守末端、3′-保守末端及中间的可变区，可变区可在整合酶作用下插入一个或者多个耐药基因盒，使得细菌表现出相应耐药特征。根据5′-保守末端中编码整合酶IntⅠ基因的不同，整合子目前可以分为6类，最常见的是Ⅰ类整合子,其次是Ⅱ、Ⅲ类整合子。

基因盒通常是碱基数目较少的、可移动的环状DNA小分子，一般可单独存在，通过整合酶及启动子的作用，基因盒才可能完成转录并表达。基因盒编辑的基因有限，所以一般不含有启动子，只有被整合子捕获后并插入到整合酶基因上特殊的位点时才能依靠整合子上的启动子进行转录及表达。能够整合到整合子上的基因盒主要为耐药基因盒，一般由其所编码的基因名字对其命名[12]。因耐药基因盒可被自由剪切或整合，从而导致基因盒在细菌之间相互传递[13]。相关研究显示，基因盒中最常见的是aadA和dfrA基因盒[14-15]。

本研究所收集的105株肺炎克雷伯菌分离株中，非多重耐药肺炎克雷伯菌有52株(49.5%)，多重耐药肺炎克雷伯菌有53株(50.5%)，53株中有35株是产ESBLs的肺炎克雷伯菌，剩余18株是同时产ESBLs和CRKP的肺炎克雷伯菌，本次收集标本中无仅产CRKP的肺炎克雷伯菌，可见产CRKP的肺炎克雷伯菌同时对青霉素、头孢类、喹诺酮类等有着较高的耐药性。

通过对105株肺炎克雷伯菌分离株进行检测，发现Ⅰ类整合子61株(58.1%)，未发现Ⅱ、Ⅲ类整合子菌株。61株中38株(62.3%)为多重耐药肺炎克雷伯菌，23株(37.7%)为非多重耐药肺炎克雷伯菌，由此可见，Ⅰ类整合子在多重耐药和非多重耐药肺炎克雷伯菌中的分布差异极为明显，多重耐药肺炎克雷伯菌分离株中Ⅰ类整合子的检出率明显高于非多重耐药肺炎克雷伯菌。

本研究中对61株有Ⅰ类整合子菌株的可变区进行PCR扩增，凝胶电泳试验后凝胶块经凝胶成像系统显示，有39株出现亮条带，39株可变区扩增产物送测序，测序结果经基因比对，其中有27株比对出了5种耐药基因，分别是磺胺类dfrA1、dfrA12和氨基糖苷类aadAl、aacA4、aadA2。结合菌株的耐药表型结果分析，耐药基因盒与耐药表型有一定的相关联系，但有些菌株表达了耐药表型却未检出所对应的耐药基因盒，如27株菌株都对喹诺酮类耐药，却未检出相应的耐药基因盒qnrVc1，其中有13株菌株对亚胺培南耐药，却未检出相应的耐药基因盒blaKPC，说明耐药表型与耐药基因盒不是完全对应的，还需进一步研究其他的耐药机制。

综上所述，芜湖地区肺炎克雷伯菌以Ⅰ类整合子为主，未发现Ⅱ、Ⅲ类整合子，多重耐药肺炎克雷伯菌较非多重耐药肺炎克雷伯菌的整合子检出率高，整合子可变区的携带基因盒与细菌耐药性有着相关关系，耐药基因和耐药表型具有一致性，且细菌存在多种耐药机制。根据研究结果显示，芫湖地区肺炎克雷伯菌对氨基糖苷类及磺胺类抗菌药物耐药率较高，应尽量避免此类抗菌药物的使用。