王 欣，任英红，丁 鹏，王力宏，荆冠军，谢英瑛，刘维帅

陕西省商洛市中心医院：1.肿瘤科；2.病理科，陕西商洛726000；3.陕西省杨凌示范区医院病理科，陕西咸阳 712100

肺癌作为一种发病率最高的恶性肿瘤，严重损害人类的健康。目前，肺癌的5年生存率还不足15%，虽然肺癌研究不断推进和发展，新型药物也不断研发，但是并没有显著提高肺癌患者总生存期，也没有明显降低其发生率[1]。非小细胞肺癌作为肺癌的主要类型，约占85%，近些年国内外流行病学研究显示，非小细胞肺癌病理类型分布比例发生了变化，肺腺癌所占比例上升，甚至超过了肺鳞癌的发病率[2]。

CDK20是细胞周期蛋白依赖性激酶家族最新发现的成员。自2004年发现CDK20敲除对人类宫颈癌细胞Hela细胞的生长抑制作用以后，越来越多的研究显示，CDK20作为癌基因在肿瘤发生、发展的调控机制中扮演着重要角色。在肝癌、脑胶质细胞瘤、结肠癌、肺癌、胃癌等多种肿瘤中发现，CDK20通过参与不同的信号调节通路对肿瘤细胞的生长、肿瘤的免疫微环境等发挥着重要作用[3]。本研究采用免疫组织化学法检测CDK20在肺腺癌组织中的表达情况，分析CDK20表达与肺腺癌临床特征之间的关系，并探讨表达情况与预后的相关性，旨在探索肺腺癌靶向诊疗新的标志物。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2002-2017月于商洛市中心医院进行肺癌手术切除和活检，病理确诊为肺腺癌且临床资料完整的患者127例为研究对象。患者男65例，女62例，年龄39～75岁，平均(62.0±7.9)岁。所有患者均按照国际抗癌联盟第八版肺癌TNM分期标准进行分期。T：原发病灶；N：淋巴结转移；M：远处器官转移。临床分期Ⅰ期18例，Ⅱ期25例，Ⅲ期32例，Ⅳ期52例，所有患者均为初治患者，术前均未行放化疗。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学染色 患者石蜡包埋的标本切片固定后脱蜡水化，加入过氧化氢室温孵育15 min。采用PBS漂洗3次，共6 min，滴加5%BSA封闭60 min。加入一抗CDK20(Origene Technologies)后4 ℃冰箱过夜。PBS漂洗后加入二抗，室温孵育30 min，PBS再次漂洗，加入DAB染色，苏木精对比染色，脱水、透明、固定。结果判定：CDK20阳性为细胞质中出现棕黄色或棕褐色颗粒，细胞核为棕黄色。CDK20在肺腺癌组织中的表达按照免疫组织化学染色评分进行分析。随机选取5个视野计算阳性细胞数量，计算染色评分，染色评分=染色深度得分×染色细胞比例得分。染色深度得分：阴性为0分，低表达为1分，中表达为2分，高表达为3分；染色细胞比例得分：0～25%为1分,>25%～50% 为2分,>50%～75%为3分,>75%为4分。染色评分0分为阴性表达组，>0～8分为低表达组，>8分为高表达组[4]。

1.2.2随访情况 采用门诊方式持续随访，截止日期为2019年12月，第1年每3个月随访1次，之后每6个月随访1次，记录肺腺癌患者相关生存时间。

1.3统计学处理 采用SPSS20.0统计学软件进行统计分析，计数资料以率(%)表示，采用χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比较采用Log-rank检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CDK20 在肺腺癌细胞中的染色特点 CDK20在肺腺癌癌组织细胞中均有不同程度的表达，肺腺癌癌组织染色强度明显高于癌旁组织，肺腺癌癌旁组织阴性表达例数也明显高于肺腺癌癌组织。同时，肺腺癌癌组织阳性病例的百分率也明显高于癌旁组织(50.0%vs.5.5%)。CDK20在肺腺癌癌组织肿瘤细胞的细胞质和细胞核中均有表达，但主要表达于细胞质，阳性细胞呈棕黄色或棕褐色颗粒分布。本研究对转移淋巴结进行染色，转移淋巴结肺腺癌肿瘤细胞也呈CDK20高表达。见图1、 2。

2.2CDK20表达水平与肺腺癌临床特征的关系 肺腺癌癌组织CDK20高表达比例明显高于癌旁组织(P<0.01)，见表1。将阴性组和低表达组进行合并以后，进行CDK20表达与肺腺癌临床特征分析，结果显示，肺腺癌患者不同性别、年龄与CDK20表达无明显相关性(P>0.05)。原发灶T分期较晚的组织CDK20相对高表达，T2～T4期患者癌组织CKD20高表达占比为94.0%，T1期患者占比为6.0%。肺腺癌晚期伴有远处转移(M1期)的患者癌组织也呈现明显的CDK20高表达状态(P<0.05),有远处转移的患者CDK20高表达(61.25%)比例明显高于无转移患者(38.8%)。临床Ⅲ～Ⅳ期CDK20高表达患者比例(88.0%)明显高于其他分期患者比例(12.00%)。见表2。

2.3CDK20表达与肺腺癌患者预后的关系 对CDK20高表达组和阴性+低表达组患者总的生存时间进行分析，虽然CDK20高表达组总的生存期较短，但差异无统计学意义(P>0.05)。考虑到研究对象中肺腺癌晚期转移患者的例数占比较大，进一步对晚期转移患者(Ⅳ期)的总生存期进行分析，结果显示，CDK20高表达的晚期转移患者总生存期明显短于CDK20阴性+低表达患者(P<0.05)。见图3、4。

注：A表示肺腺癌HE染色(×100);B表示癌旁组织CDK20低表达(×200);C表示癌组织CDK20高表达(×200);D表示转移淋巴结组织CDK20表达阳性(×200)。

注：A表示低表达;B表示中表达;C表示高表达。

表1 肺腺癌癌组织和癌旁组织中CDK20蛋白表达染色评分分组情况比较[n(%)]

表2 CDK20表达与肺腺癌临床特征的关系[n(%)]

图3 127例患者总生存分析生存曲线

图4 61例Ⅳ期患者总生存分析生存曲线

3 讨 论

早在2004年就有研究显示，宫颈癌细胞中敲除CDK20后肿瘤细胞克隆生长得到明显抑制，而这是通过活化CDK2磷酸化抑制实现的[4-5]。CDK20是含有11个保守丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，CDK20基因位于染色体上的9q22.1，基因组长度为8 kb，具有7个外显子，并且其作为一种癌基因在包括肝癌、结肠癌、脑胶质瘤的发生、发展过程中起到重要的调控作用[5]。

本研究结果显示，CDK20在肺腺癌组织和转移淋巴结组织中明显高表达。CDK20染色定位在肿瘤细胞的细胞核和细胞质，这些结果提示CDK20可能通过肺腺癌细胞的细胞质和细胞核信号通路对肺腺癌生物学特性发挥调控作用。CDK20通过调节CDK20的磷酸化，并通过影响G1/S-特异性周期蛋白(Cyclin) D1和Cyclin E来控制胶质瘤、卵巢癌和结肠癌细胞的生长和增殖。而在肝癌细胞中CDK20活化β-catenin/T细胞因子活化信号通路可促进肝癌的发生。 同时，CDK20与核因子E2相关因子2竞争，与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1结合，降低细胞活性氧的水平，影响放化疗的敏感性[6]。这些穿梭于细胞内结构之间的CDK20信号通路调节机制使CDK20具有作为癌基因的作用。肝癌、脑胶质瘤及结肠癌临床研究显示，CDK20高表达患者不良预后较差，因此，CDK20可能成为临床肿瘤预后评估的有效生物学指标[7-8]。目前，CDK20如何影响肺腺癌的机制还有待进一步研究，CDK20通过调节免疫微环境各种肿瘤相关细胞因子发挥抗肿瘤的作用，不断更新研究者对CDK20的认识[9]。

本研究数据显示， 61.2%有远处转移患者肺腺癌癌组织中CDK20高表达(>8分)。Ⅰ期和Ⅱ期总共只有8例(12.0%)患者CDK20高表达，而Ⅲ、Ⅳ期59例(88.0%)患者肺腺癌组织中CDK20高表达，远高于Ⅰ、Ⅱ期患者比例。这些结果提示，CDK20的高表达可能参与肺腺癌的进展及促进肿瘤的远处转移。而在随访结果中，虽然CDK20高表达组患者有相对较差的预后生存期，但差异无统计学意义，进一步对Ⅳ期晚期转移的患者随访数据进行分析，结果显示，CDK20高表达组患者其生存期明显缩短。本研究结果提示，CDK20表达强度也就是CDK20在肿瘤组织中的表达量，与肺腺癌的病情进展及转移有关，这使得CDK20表达可能可以作为预后预测的一项重要的参考指标。已有研究显示，CDK与肺癌有着广泛的联系，包括Cyclin D、Cyclin E、CDK1和CDK2等都与肺癌发生、发展相关，研究者也在进行CDK2和CDK7的抑制剂针对肺癌的作用机制研究[10-12]。目前鲜见CDK20参与肺腺癌调控作用机制和肺腺癌预后研究的文献，尤其是用免疫组织化学这种临床常用方法检测分析。本研究对肺腺癌临床标本进行CDK20免疫组织化学法染色并分析其在诊断和预后中的作用，这为进一步研究CDK20作用机制和作为治疗靶点提供了线索。

综上所述，CDK20与肺腺癌发生、发展密切联系，CDK20高表达可能提示肺腺癌患者不良预后。这有助于深入理解肺腺癌肿瘤侵袭、转移分子机制，对寻找新的肺癌治疗靶点、预后评估有一定的参考价值。但本研究方法较单一，还有待在细胞转录水平和动物模型上进一步研究CDK20的表达和功能。