彭丹 何秋水

首都医科大学基础医学院病原生物学系,北京100069

肺炎支原体 (Mycoplasma pneumoniae,MP)介于细菌和病毒之间,可在无细胞培养基上独立生存,无细胞壁,呈多种形态,主要经飞沫传播。MP 感染以冬春季节多见[1]。MP 是引起儿童社区获得性肺炎 (communityacquired pneumonia,CAP)的主要病原体之一,占儿童CAP病例的40%。此外,多达18%的肺炎支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP)儿童患者需要住院治疗[2]。虽然MPP 通常被认为是一种自限性疾病,但近年来严重病例甚至致命病例报道越来越多[3]。MP感染的具体致病机制尚不明确,但研究证实MP 感染细胞介导的免疫反应及大量细胞因子的释放在发病过程中起着重要作用。近年来发现,一些细胞因子可作为生物标志物被用于MP感染的病原学诊断及严重程度评估[4]。最新研究表明,肺炎患者呼吸道菌群与正常儿童存在显著的差异,MPP可使呼吸道菌群明显改变[5]。因此,呼吸道菌群作为一种重要因素,可能对呼吸道免疫反应及相关疾病发生存在直接的影响甚至发挥更重要的调控作用。本文将对MP感染中呼吸道菌群和重要细胞因子的作用进行综述,为进一步精准诊断、个性化治疗和有效干预提供理论依据。

1 MP感染呼吸道菌群的改变

健康人体呼吸道黏膜表面定植着大量的细菌,其中主要的菌门包括厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门、变形杆菌门和梭杆菌门。健康状态下细菌与人体形成互利共生的状态。而细菌之间通过群体感应系统和局部产生的抗微生物多肽调节细菌种类和数量以保持动态平衡[5]。上下呼吸道菌群具有高度同源性,但上呼吸道菌群数量较下呼吸道多。MP感染后可导致呼吸道菌群失调,致病菌的丰度增加引起炎症和免疫反应,从而导致病情加重。

1.1 上呼吸道菌群的改变 健康学龄儿童口咽部(oropharyngeal,OP)菌群优势菌属为拟杆菌属、放线菌属及变形菌属[6]。鼻咽部 (nasopharyngeal,NP)菌群构成主要以葡萄球菌属、棒状杆菌属和丙酸菌属等为主[7]。大量报告显示,肺炎患者的上呼吸道菌群多样性和丰富度较低,从而导致菌群失调。孙玲玲等[8]在研究中分析了MP感染对儿童OP 菌群变化的可能影响。MPP 患儿OP菌群多样性比健康儿童明显降低。在门水平上,变形菌门、拟杆菌门和梭杆菌门在健康儿童中相对丰度显著高于MPP患儿组,而厚壁菌门、柔膜菌门和放线菌门在MPP患儿组中相对丰度均显著高于健康儿童组;在属水平上,葡萄球菌属、放线菌属、不动细菌属、阿托波菌属、棒状杆菌属和营养缺陷菌属在MPP患儿中显著增加 (表1)。Dai等[9]研究结果显示,在健康儿童中发现OP 菌群主要是普氏菌属和链球菌属。与健康儿童相比,MPP 患儿OP 微生物多样性及相关基因数量减少,支原体属及葡萄球菌属在MPP患者中显著增加 (表1)。

Sakwinska等[12]首次研究了NP 菌群构成与肺部感染的关系,发现儿童的鼻咽微生物群的改变与疾病的发生存在一定关系。Lu等[10]纳入119例患儿 (年龄中位数为2.8岁),其中MPP 患儿60 例,健康儿童59 名。无论是NP菌群还是OP菌群,患者组与健康儿童组均有显著性差异,患病儿童的微生物多样性较低。在MPP 患者中,NP 和OP菌群之间有较大的相似性,提示NP菌群可能向OP传播。所有儿童的OP 和NP 菌群中均以厚壁菌门为主,但在肺炎患者中显著增加;拟杆菌门在健康儿童的OP和NP菌群中富集。在属水平上患者无论是NP 菌群还是OP 菌群支原体属、葡萄球菌属、乳酸杆菌属、劳尔菌属、不动杆菌属和放线菌属显著聚集,而普雷沃菌属在健康儿童中尤其丰富 (表1)。

有研究表明健康儿童和患病儿童之间存在不同的NP和OP菌群。一项前瞻性研究结果显示,呼吸道感染 (中耳炎、呼吸道合胞病毒感染和哮喘)儿童的NP 和OP 之间不平衡菌群的传播可能进一步引发肺部感染[13]。

上呼吸道菌群在肺炎中可以预测疾病严重程度,乳酸杆菌属、罗氏菌属或肺炎链球菌属的相对丰度与肺炎严重程度有关[12]。

1.2 下呼吸道菌群的改变 随着生物技术的发展,采用下一代测序技术可知肺部含有很多细菌。MP 感染时肺微生态紊乱,下呼吸道菌群失调,伴随免疫功能紊乱,自然杀伤细胞和中性粒细胞过度激活,从而导致呼吸道疾病进展。Dai等[5]纳入28 例MPP 患者,32 名健康儿童为对照组,分析支气管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid,BALF)菌群得出MPP患者支原体属显著增加,嗜血杆菌属及葡萄球菌属为肺部菌群的优势菌属。而且入院治疗的MPP患者住院时间长,发热峰值较高及血清C反应蛋白升高明显,说明MPP患者肺部菌群失调与疾病严重程度显著相关。Wang等[11]在研究中利用Shannon's指数显示BALF菌群多样性的差异,发现MPP组的多样性低于腺病毒肺炎(adenoviral pneumonia,AVP)和气管软化组。PCA 分析还显示在MPP、AVP 和气管软化组的微生物样本之间存在差异。在菌门水平上,气管软化组和MPP组分别以变形杆菌门及柔膜菌门为主;而AVP患儿肺菌群中厚壁菌门的丰度最高。在属水平上,MPP、AVP和气管软化组肺部菌群分别以支原体属、链球菌属及假单胞菌属为主。在MPP患者中肺部菌群与IL-4、IL-5、IL-6、肿瘤坏死因子1α(tumor necrosis factor-1α,TNF-1α)、IL-1α的表达有显著相关性 (表1)。在多项研究中发现肺炎患者肺部菌群,除乳球菌属、假单胞菌属、普氏杆菌属、梭杆菌属,还发现了嗜血杆菌属和奈瑟菌属,而且葡萄球菌属和链球菌属数量均有所增加[14-15]。肺部菌群的改变可帮助我们进一步诊断MPP及严重性进行评估,以便及时进行治疗。

表1 肺炎支原体感染对呼吸道菌群的影响

2 MP感染中细胞因子的情况

虽然MP的确切致病机制尚不清楚,但近年来细胞因子在MP感染中的作用已引起广泛关注。细胞因子是一组由激活的淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等细胞分泌的信号分子。它们既是体液免疫反应的重要组成部分,也是细胞免疫反应的重要组成部分,它们通过与靶细胞膜上的特定受体结合来发挥其生物学效应。细胞因子在宿主抵御细菌或病毒感染以及其他有害因素方面起着至关重要的作用。接下来我们将讨论与MP感染相关的几种重要细胞因子 (表2)。

2.1 IL-1家族 IL-1 被认为是 “典型的多功能”细胞因子,几乎可以影响每一种细胞类型。在动物模型中,BALB/c小鼠肺部在急性和继发性感染中IL-1βm RNA 水平上调[24]。在C57BL/6 小鼠感染模型中进一步证实肺内CD4+T 细胞浸润可能是导致IL-1β升高的原因之一[25]。与动物实验结果一致,MP引起的CAP患者与肺炎链球菌引起的CAP 患者相比急性期和恢复期血清IL-1β水平均升高[26]。Yang等[16]研究结果显示MPP 患儿较对照组IL-1β显著升高。

2.2 IL-2和IL-2R IL-2主要由Th1细胞产生,它的活性反映了体内Th1细胞的功能。IL-2R 是IL-2受体亚家族的一员,以3种形式存在,包括单体IL-2Rα、二聚体IL-2Rβγ和三聚体IL-2Rαβγ。在BALB/c小鼠感染模型中,可以检测到IL-2和IL-2R 的表达,但IL-2 m RNA 的表达水平在24 h后迅速下降[24]。在MP 感染患者的BALF 中检测到IL-2水平升高,血清可溶性IL-2R 水平也显著升高,重度患者血清可溶性IL-2R 值明显高于轻度患者[27]。同样Yang等[16]在MPP中发现IL-2有助于区分重度MPP与轻度MPP及对照。可见监测IL-2的水平可反映MPP的炎症情况,尽早发现重症MPP患者。

2.3 IL-4 IL-4主要由Th2细胞分泌,它的水平代表Th2活性。由于IL-4的产生导致免疫系统产生Th2依赖性的过敏反应,它与过敏和哮喘等特应性疾病有关。在BALB/c小鼠感染模型中研究发现MP 接种后18个月左右IL-4有升高的趋势[28]。相比之下,Hayakawa等[29]报道称,MP感染在无菌IQI/Jic小鼠脾脏细胞中导致IL-4生成显著增加。Koh 等[17]测 定MPP 患 者 的BALF 上 清 液 中IL-2、IFN-α和IL-4的水平,研究结果显示与对照组相比,MPP组的IL-4水平和IL-4/IFN-γ比值明显升高,而IFN-γ则无明显升高,说明MP感染主要引起Th2型细胞因子为主的免疫应答。

2.4 IL-6 IL-6是另一种重要的促炎细胞因子,对体液免疫和细胞免疫均有调节作用。IL-6作用于B 淋巴细胞,使其大量增殖导致过度免疫,从而加重MP 感染。它是炎症急性期反应的标志。MP感染患者血清IL-6水平升高,血清IL-6浓度可能是MP 感染严重程度和预后的潜在指标。Zhang等[4]对收治的634例MPP患儿进行回顾性分析,结果IL-6、IL-10、IFN-γ 及中性粒细胞百分率、CD8+均显著高于普通肺炎支原体肺炎 (general Mycoplasma pneumoniae pneumonia,GMPP)组。经分析显示IL-6 可能是儿童难治性肺炎支原体肺炎 (refractory Mycoplasma pneumoniae pneumonia,RMPP)的显著预测因子,有助于RMPP的早期识别[18]。田芳等[19]分析了48例MPP 急性期患儿 (重症组和轻症组分别为21例和27例)和30名健康儿童 (对照组)TNF-α、IL-6 和半乳凝素3 的浓度。其研究结果表明血清TNF-α、IL-6 和半乳凝素3 在MPP的发生发展过程中起重要作用,其血清浓度可反映MPP患儿的病情轻重。Wang等[11]研究的结果显示,MPP组肺菌群与IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α和IL-1α浓度有很强的相关性。可见IL-6可作为病情严重的生物标志物。

表2 肺炎支原体感染细胞因子的变化情况

2.5 IL-8 炎症的一个方面是中性粒细胞向炎症部位的外渗,这是在局部分泌的趋化因子的帮助下完成的。IL-8是中性粒细胞、单核细胞和T 淋巴细胞的有效趋化和活化因子,因此是细菌感染或其他刺激时中性粒细胞流入肺部的主要因素。Chen等[2]探讨了中性粒细胞活性、临床表现以及MP/IL-8/中性粒细胞轴在MPP发病中的作用。在此研究中体外检测MP感染支气管上皮细胞后不同时间点IL-8的产生,并分析IL-8刺激后中性粒细胞的活性。MP 以时间依赖的方式诱导支气管上皮细胞产生IL-8。IL-8刺激后,中性粒细胞产生基质金属蛋白酶9、髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶的量较对照组明显增加。总之MP/IL-8/中性粒细胞轴可能在MPP的发病机制中起重要作用。Arae等[30]研究者研究MP-Ag刺激支气管上皮细胞 (A549)时表皮生长因子受体通路对IL-8 生成的影响,IL-8 生成增加,促进了MP感染的炎症反应。

2.6 IL-10 IL-10是一种抗炎细胞因子。炎症与慢性肺病的发展有关,及时抑制炎症反应对机体的健康至关重要。Zhang等[20]比较RMPP 组与GMPP 组的血清细胞因子水平,结果显示RMPP组细胞因子IL-6、IFN-γ、IL-10均显著高于GMPP组。IL-10 和IFN-γ可作为学龄儿童RMPP的良好预测因子。在研究中MPP 患者血清IL-8、IL-18、IL-10水平较对照组明显升高[31]。Medjo等[32]研究发现,MPP患儿与非MPP 患儿血清IL-4 水平差异无统计学意义,而MPP患儿IL-10水平明显高于非MPP患儿。

2.7 IL-17 IL-17是一种主要由活化的T 细胞产生的致炎细胞因子。Kurai等[33]研究者在BALB/c小鼠腹腔内注射MP提取物,以模拟人体内的重复MP 感染的情况,结果显示IL-6、IL-17、TNF-α水平明显升高。

Fan等[21]研究发现MPP患儿BALF中IL-1Ra、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α水平较血浆明显升高。RMPP患儿血浆IL-6 水平虽高于GMPP 患儿,但IL-17 水平呈相反趋势。RMPP组儿童BALF中IL-8、IL-17、TNF-α水平明显高于GMPP 组,IL-17 水平升高与病灶大小增加相关。BALF中IL-17及相关细胞因子的升高提示MPP患儿的局部炎症反应应与全身炎症反应相鉴别。此外,RMPP 可能与感染部位的炎症恶化有关。IL-17水平可能与MPP 肺损害的程度和严重程度有关。

Yang等[22]研究发现重度MPP组IL-17A 的m RNA 水平明显低于轻度MPP 组和小儿支气管异物组。IL-17A 可用于区分重度MPP和轻度MPP。而且IL-17A 水平与某些临床特征有关。难治性MPP患儿和有胸腔积液的MPP患儿IL-17A水平较低。严重MPP患儿BALF中IL-17A 蛋白水平也明显下降。因此,BALF中IL-17A 水平的降低可能是鉴别儿童重度MPP的一个有价值的生物标志物。

2.8 IFN-γ IFN-γ可由Th1、杀伤T 细胞、自然杀伤细胞分泌,以炎症细胞为靶点,介导对迟发型超敏反应至关重要的各种效应。在BALB/c和C57BL/6小鼠MP感染模型中检测到IFN-γ表达。在MPP患者的血清中已经发现了IFN-γ水平增加,而且可作为学龄儿童RMPP 的良好预测因子[20]。Sekine等[34]以鼻内感染MP或接种MP抗原 (可溶性抗原和部分纯化抗原)的无菌小鼠为研究对象,探讨免疫应答的致病意义。IFN-γ在内源性细胞因子表达中起主导作用。

2.9 TNF-α TNF-α是另一种重要的促炎细胞因子,参与急性和慢性炎症反应。TNF-α 在肺部炎症中也起重要作用。TNF-α在MP 感染BALB/c小鼠的模型中表达增加。同样,MP感染也会诱发TNF-α在C57BL/6小鼠模型中的表达。Li等[23]共收集了71 例MPP 患儿 (年龄1 月至14岁),其 中RMPP 患 者21 例,NRMPP 患 者50 例;22 例小儿支气管异物为对照组。与对照组相比,MPP 组TNFα、IFN-γ、IL-36、IL-8、IL-6 和IL-4 水平升高;然而在RMPP组中TNF-α及IL-6 水平明显高于NRMPP 组,经ROC 曲 线 分 析,只 有TNF-α 可 作 为 区 分RMPP 和NRMPP的生物标志物。

3 小结与展望

长期以来,MPP通常被认为是一种自限性疾病。近年来,严重病例甚至致命病例报道越来越多,而且下一代测序技术发现呼吸道含有很多新的细菌。呼吸道菌群对肺部健康和肺部疾病发生和发展起到重要作用。在MP 感染过程中,诱导产生的各种细胞因子是肺部防御和发生炎症的重要介质。对呼吸道菌群及多种细胞因子的检测有利于对MP感染进行病原学诊断、判断感染轻重、实施早期免疫干预,进而阻止疾病进一步恶化。然而呼吸道菌群在MP感染中的具体作用机制及呼吸道菌群改变与细胞因子的关系有待进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突