张 璐，姜志戎，尹 萌，胡 旭，朱殿雨，田 静

（1.扬州市食品药品检验检测中心，江苏 扬州225000；2.宝应县中医医院，江苏 扬州225800）

益肾壮骨丸是宝应县中医医院获得专利授权的独家制剂，由山萸肉、枸杞子、杜仲、白芍、赤芍等10余味中药组方，具有补益肝肾、壮骨强身、活络通经的功效，主要用于肝肾亏虚、筋骨瘘弱引起的腰腿痛、关节痛、腰膝酸软、四肢无力等病症，临床应用广泛且疗效确切[1]。方中山萸肉为君药，白芍和赤芍为臣药，莫诺苷、马钱苷为山萸肉的主要活性成分[2－6]，芍药苷为白芍和赤芍的主要活性成分[7－11]。本方药味较多，但现行标准仅有性状鉴别和常规检查项，无法有效控制产品质量。本研究中以芍药苷、莫诺苷和马钱苷为指标成分，建立了同时测定益肾壮骨丸中3种成分含量的高效液相色谱（HPLC）法[12－13]。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260型高效液相色谱仪（包含DAD检测器，美国安捷伦科技有限公司）；Mettler Toledo XS205 DU型分析天平（瑞士梅特勒－托利多公司，精度为十万分之一）；KH－400KDE型高功率数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司，功率为300 W，频率为50 kHz）；OGH60型电热恒温干燥箱（美国赛默飞世尔科技公司）；Milli－Q型超纯水仪（美国密理博公司）；BT－150型多功能粉碎机（浙江拜杰电器有限公司，功率为550 W，频率为50～60 Hz）。

1.2 试药

益肾壮骨丸（宝应县中医医院，批号分别为20181119，20181203，20181218，规格为每盒45 g）；芍药苷对照品（批号为110736－201741，含量为95.7%），莫诺苷对照品（批号为111998－201602，含量为96.3%），马钱苷对照品（批号为111640－201808，含量为99%；批号为111640－201606，含量为98.3%），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈(色谱纯，北京迪马科技有限公司）；甲醇、乙醇、磷酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈（A）－0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脱程序见表1；流速：1 mL／min；检测波长：230 nm（芍药苷），240 nm（莫诺苷、马钱苷）；柱温：30℃；进样量：10μL。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2 溶液制备

供试品溶液：取样品粉末（过5号筛）5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理（功率为300 W，频率为50 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

混合对照品溶液：分别取芍药苷、莫诺苷和马钱苷对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，分别制成质量浓度1.172，0.587，1.019 mg／mL的对照品贮备液。精密吸取芍药苷贮备液5 mL、莫诺苷贮备液1 mL、马钱苷贮备液3 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释成每1 mL含芍药苷586.0μg、莫诺苷58.7μg、马钱苷305.7μg的混合对照品溶液，避光保存。再用甲醇稀释成每1 mL含芍药苷293.0μg、莫诺苷29.4μg、马钱苷152.9μg的混合对照品溶液。

阴性对照品溶液：按处方比例和制备工艺制备缺山萸肉、白芍和赤芍（芍药苷）的阴性样品，取阴性样品粉末，按供试品溶液制备方法制备，即得。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪测定，记录色谱图。结果见图1。芍药苷、莫诺苷和马钱苷色谱峰的理论板数均不低于5 000，与相邻峰的分离度均大于1.5。

专属性试验：分别取不同批次（批号分别为20181119，2181203，20181218）样品及山茱萸、芍药苷阴性样品粉末，依法制备供试品溶液和阴性对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定，并记录色谱图。详见图1。结果3批样品均检出莫诺苷、马钱苷和芍药苷的色谱峰，阴性样品均未检出相应色谱峰，益肾壮骨丸中其他成分对芍药苷、莫诺苷和马钱苷未造成干扰，表明方法专属性良好。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：取混合对照品贮备液适量，用甲醇稀释成6个不同质量浓度的混合对照品溶液，芍药苷质量浓度分别为29.30，58.60，117.20，293.00，468.80，586.00μg／mL，莫诺苷质量浓度分别为2.94，5.87，11.75，29.37，46.99，58.74μg／mL，马钱苷质量浓度分别为15.29，30.57，61.14，152.85，244.56，305.70μg／mL。取上述溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。以各对照品的质量浓度（X，μg／mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得芍药苷、莫诺苷、马钱苷的回归方程，Y芍＝14 678 X芍＋9 569（r＝0.999 8），Y莫＝16 194 X莫＋4 280（r＝0.999 7），Y马＝16 186 X马＋9 019（r＝1.000 0）。结果表明，芍药苷、莫诺苷和马钱苷的质量浓度分别在29.30～586.00，2.94～58.74，15.29～305.70μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

检测限与定量限确定：分别取芍药苷、莫诺苷、马钱苷对照品贮备液适量，加甲醇稀释成适当质量浓度的溶液，取10μL进样分析。以信噪比（S／N）＝3为指标，结果芍药苷进样质量浓度为0.44μg／mL，即检测限为4.4×10－3μg；莫诺苷进样质量浓度为0.29μg／mL，即检测限为2.9×10－3μg；马钱苷进样质量浓度为0.31μg／mL，即检测限为3.1×10－3μg。以S／N＝10为指标，结果芍药苷进样质量浓度为1.46μg／mL，即定量限为14.6×10－3μg；莫诺苷进样质量浓度为0.98μg／mL，即定量限为9.8×10－3μg；马钱苷进样质量浓度为1.02μg／mL，即定量限为10.2×10－3μg。

精密度试验：取混合对照品溶液，按拟订色谱条件连续进样6次，记录色谱图。结果芍药苷、莫诺苷和马钱苷峰面积的RSD分别为0.53%，0.99%，0.55%（n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为20181119）粉末，依法平行制备6份供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，计算含量。结果芍药苷、莫诺苷和马钱苷含量的RSD分别为0.57%，0.84%，0.69%(n＝6)，表明方法重复性良好。

稳定性试验：取样品（批号为20181119）粉末，依法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，4，8，12 h后按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果芍药苷、莫诺苷和马钱苷的峰面积均无明显变化，RSD均小于1%(n＝4)，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

加样回收试验：取样品（批号为20181119）粉末（过5号筛）2.5 g，精密称定，精密加入含芍药苷293.0μg、莫诺苷29.4μg、马钱苷152.9μg的混合对照品溶液15 mL，平行制备6份，按拟订色谱条件进样，测定各待测成分含量，并计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验（n＝6）

耐用性考察：分别采用Agilent1260型和Waters e2695型液相色谱仪，以及Agilent Eclipse XDB－C18、Inertsil ODS－SP C18、Alltima C18色谱柱测定对照品溶液和供试品溶液，结果待测成分分离均较好，对含量测定结果也无影响，表明该方法耐用性良好。

2.4 样品含量测定

取不同批次（批号分别为20181119，20181203，20181218）样品粉末，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定各待测成分含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果（mg／g）

3 讨论

3.1 色谱条件选择

分别考察了乙腈－磷酸、乙腈－水、甲醇－醋酸的流动相体系，并综合比较峰形、分离度、出峰时间等参数，选择以乙腈－0.3%磷酸溶液梯度洗脱为流动相。在200～400 nm波长范围内进行扫描，选择有最大吸收且干扰峰较少的230 nm波长测定芍药苷，240 nm波长测定莫诺苷、马钱苷。

3.2 样品前处理方法考察

提取溶剂与提取方法：取样品（批号为20181218）粉末（过5号筛）5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，共8份。分别为甲醇加热回流组、甲醇超声组、70%甲醇加热回流组、70%甲醇超声组、乙醇加热回流组、乙醇超声组、70%乙醇加热回流组和70%乙醇超声组，分别精密加入对应提取溶剂50 mL，并按对应提取方法提取30 min，考察待测成分的含量。结果表明，甲醇提取的各待测成分的含量均大于乙醇；加热回流提取法与超声提取法相比，未见更多的色谱峰信息，且待测成分含量差异不大，超声提取法更方便快捷，故选择以甲醇超声提取。

提取时间：考察了不同提取时间下待测成分的含量差异。取样品粉末（过5号筛）约5 g，3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，分别超声提取30，45，60 min。结果表明，3份样品中待测成分的含量无明显差异，故选择超声处理30 min。