张开虹 桑维钧 刁朝强 石春发

摘要：烟草白粉菌是一种专性寄生菌，且田间很难发现其有性态，故烟草白粉菌是如何进行初侵染还不是很明确。为了解烟草周边寄主白粉菌与烟草白粉菌的相关性，确定周边寄主引起烟草白粉病发生的地位

，本研究在贵阳周边的清镇、开阳、修文、贵安新区等烟草基地对烟草周边白粉菌植物进行调查采集、形态学鉴定，并建立植物白粉病菌的rDNA-ITS系统发育树，确定相互间的亲缘关系。此次共调查了烟田周边白粉菌植物16个科的30种植物，其中菊科植物种类最多，为8种;其次是豆科植物4种;调查的30种植物中，三叶鬼针草（菊科）、豨莶（菊科）、酸模叶蓼（蓼科）、短序铁苋（大戟科）、朴树（榆科）等5种植物发现有性型，形态学鉴定分别为单囊壳属Sphaerotheca、单囊壳属Sphaerotheca、白粉菌属 Erysiphe、白粉菌属 Erysiphe、白粉菌属 Erysiphe，与ITS（ITS4/5）比对的结果一致;经构建几种白粉菌属植物种间ITS系统发育树表明，所采寄主白粉菌与烟草白粉菌不是同一个种，在分子亲缘关系上相关性不大。

关键词：烟草;寄主;白粉病菌;相关性;系统发育

中图分类号：S435.72

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2020）02-0082-05国际DOI編码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2020.02.014

Preliminary Investigation and Correlation Analysis of Plant Powdery Mildew Near Tobacco Field

ZHANG Kaihong1， SANG Weijun1*， Diao Chaoqiang2， SHI Chunfa2

（1. College of Tobacco Science of Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China;2. Guiyang Branch Company， Guizhou Tobacco Company， Guiyang， Guizhou 550002， China;3. Guizhou Southeast Institute of Forestry， Kaili， Guizhou 556000， China）

Abstract：Tobacco powdery mildew is an obligate parasite， which is difficult to find its sexual state in the field， thus it is not very cleart how early tobacco powdery mildew infestation carried out. In order to understand the correlation between tobacco and the hosts， and determine the status of tobacco powdery mildew caused by the surrounding hosts. In this paper， we investigated powdery mildew of tobacco surrounding plants in Guiyang， Qingzhen Kaiyang， Xiuwen， Gui'an New District and other place during one year， and preliminary identified powdery mildew and build plants rDNA-ITS phylogenetic tree to determine their relatives. A total of 30 plants in 16 families of Powdery mildew plants around the tobacco field were investigated，of which the family of Compositae was the most， 8 species; followed by 4 species of legumes. Among the 30 plant species surveyed， Bidens （Asteraceae）， Herba Siegesbeckiae （Asteraceae）， pale smartweed （Polygonaceae）， short sequence iron pigweed （Euphorbiaceae）， hackberry （Ulmaceae） have sexual types and The morphological identifications were Sphaerotheca，Sphaerotheca， Erysiphe， Erysiphe， Erysiphe， the results were consistent with the ITS （ITS4 / 5）. The ITS phylogenetic trees constructed among several species of powdery mildew plants showed that the collected powdery mildew and the powdery mildew were not the same species， and there was little correlation in molecular kinship.

Keywords：tobacco; host; powdery mildew; relevance; phylogeny

烟草白粉病（Tabacco powdery mildew）是Erysiphe cichoracearum DC.引起的病害，主要靠分生孢子进行传播危害，在阴雨寡照天气下发生尤为严重，病斑初为黄褐色，近圆形，斑上覆白色粉状物，通常先发生于成熟叶片，叶脚向上逐渐蔓延，斑块扩大白粉布满整个叶片，叶片褪绿后枯死，严重时危害嫩茎，病叶烤后色暗且薄，丧失经济价值。烟草白粉菌是一种专性寄生菌，无法进行培养，目前尚没有明确烟草白粉菌是如何进行再侵染和病害循环危害烟草。烟草白粉菌在下一年再次发生危害，必须经历严寒酷暑，且烟草为一年生植物，前人关于白粉菌再侵染源的调查研究在其他植物上有过相关的报道，主要体现在以下几个方面;（1）无性态越冬。张喜萍[1]研究了温室月季白粉菌发病规律发现，月季的白粉菌分生孢子不能够通过病残体进行越冬，主要通过休眠芽里面的菌丝体进行越冬侵染危害，故温室大棚内的白粉菌可以作为下一年白粉病危害的初侵染源;（2）有性态越冬。在研究野生寄主发现周边野生寄主上的闭囊壳对小麦的侵染能力发现这些寄主在病害循环上不能起到作用[24]。杨家书等[3]还发现自生麦苗上的闭囊壳不能越冬在3、4月份引起春播小麦发病。

为了解烟草周边寄主植物白粉菌与烟草白粉菌的关系，明确其在烟草白粉菌越冬的地位，其是否是烟草白粉病病害循環中的关键因子，特展开了烟草周边植物的白粉菌调查及鉴定，并对两者之间的相关性进行分析研究。

1材料与方法

1.1试验材料及仪器

植物白粉菌采集于贵阳市周边烟草种植田附近）。试剂：无菌水、玻片、酒精灯、针、冰袋保鲜盒、Biomiga公司的真菌基因组DNA提取试剂盒、引物（ITS4 5-TCCTCC-GCTTATTGATATGC-3，ITS5 5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3）。

试验仪器：凝胶电泳仪、离心机、水浴锅、PCR仪、光学显微镜、光学体视镜、相机等。

1.2试验方法

1.2.1病原菌采集

2015年，在清镇芦荻、开阳、修文、贵安新区等烟草基地周边进行寄主白粉菌调查采样，把采集到的白粉菌装入自封袋中封好口，做好标记，把标本装入装有冰袋的泡沫盒中，带回实验室镜检及提取DNA。

1.2.2形态学观察

用透明胶带粘取白色霉层，放在滴有 3% KOH 的载玻片上，在Olympus显微镜下观察病原菌菌丝、分生孢子梗和分生孢子、附着胞、芽管等特征，并进行测量和显微拍照，结合相关文献鉴定病原菌[56]。

1.2.3DNA提取及扩增

把标本放置在光学体视镜下用挑针挑取孢子（约200个），将孢子收集到2 mL的离心管中，作为DNA提取材料，用Bioma公司生产的真菌DNA提取试剂盒对白粉菌总DNA进行提取，提取方法参照说明书。PCR反应体系为：9.5 μL ddH2O，12.5 μL 2×Tap Master Mix（天根生化科技（北京）有限公司），正反引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL。

1.2.4系统发育树建立

用MEGA 5.0对所测的白粉菌属样品ITS序列经Clustal匹配分析，并进行比对分析，基于Kimura-2-parameter双参数模型，采用邻近距离法（NJ法）构建系统进化树以推演系统发生关系，同时，采用bootstrap法，经1 000次循环检验系统进化树的可靠性。最后，对树形进行优化分析，以筛选出最适合反映烟草白粉病E.cichoracearum DC.与植物白粉菌相关性的树形。

2结果与分析

2.1植物白粉菌发生情况调查、ITS鉴定结果及部分白粉菌属形态学鉴定结果

经过一年多的烟田周边白粉菌的寄主采集，目前已经确定16个科30种植物，其中菊科植物种类最多，种数为8种，其次是豆科的4种。调查的30种植物中，三叶鬼针草（菊科）、豨莶（菊科）、酸模叶蓼（蓼科）、短序铁苋（大戟科）、朴树（榆科）等5种植物发现有性型，形态学鉴定分别为单囊壳属Sphaerotheca、单囊壳属Sphaerotheca、白粉菌属 Erysiphe、白粉菌属 Erysiphe、白粉菌属 Erysiphe，对以上采集到的部分白粉菌进行测序（ITS4/5）比较，测序结果表明，共有6种菌属于白粉菌属，寄主分别是三叶草Oxalidaceae、川榛Corylus heterophylla、紫茉莉Mirabilis jalapa、朴树Celtis sinensis、酸模叶蓼Polygonum lapathifolium、短序铁苋Acalypha brachystachya，其中有5种在野外采集到有性态，对部分的样品鉴定结果如表1所示。

2.2形态学描述

2.2.1酸模叶蓼白粉菌

酸模叶蓼白粉菌于8月份左右发病，发病初期可见叶正面有白色小点分布，病害发生严重时正反面可见白色粉层，多集中在背面，于10月份左右产生闭囊壳，闭囊壳主要分布于叶背，子囊果集生，少数散生，形态学鉴定为蓼白粉菌Erysiphe polygoni DC.。分生孢子柱状串生4～7个，大小25.0～450×13.0～19.0 μm;子囊果聚生至近聚生，少数散生，暗褐色，扁球形，直径82～137 μm，壁细胞不规则多角形，直径6～16 μm，附属丝15～35根，不分枝或不规则分枝，少数近双叉分枝

1～2次，弯曲，常作扭曲状或曲折状，长度约为子囊果的0.5～1.7倍，长45～195 μm，上下近等粗或局部粗细不匀，褐色至无色，子囊3～8个，卵形，少数近球状，有柄有时亦不见柄，45～70×30-30-40 μm，子囊孢子孢子2～5个，一般卵-椭圆形，少数卵-矩圆形，带黄色，15～30×10～15 μm。

2.2.2短序铁苋白粉菌

短序铁苋白粉菌于7月份末发病，发病初期可见叶正面有白色小点分布，病害发生严重时正反面可见白色粉层，多集中在背面，于9月中旬产生闭囊壳，闭囊壳主要分布于叶背，叶正面也有分布，子囊果多集生少散生，形态学鉴定为铁苋白粉菌Erysiphe acalyphae DC.。分生孢子柱状串生4～7个，大小23.0～46.0×14.0～20.0 μm;子囊果聚生至近聚生，少数散生，暗褐色，扁球形，直径75～125 μm，壁细胞不规则多角形，直径8～18 μm，附属丝16～28根，至子囊果上部发生，直或稍弯曲，长度约为子囊果的0.5～1倍，长60～175 μm，上下近等粗或下部略粗，子囊3～7个，卵形、近卵形至不规则卵形，有柄有时亦不见柄，27～45×30-17-26 μm，子囊孢子不能够完全出现。

2.2.3朴树白粉菌

朴树白粉菌于10月左右开始发病，发病初期可见叶正面有白色小点分布，病害发生严重时正反面可见白色粉层，多集中在正面，于11月月中旬产生闭囊壳，闭囊壳主要分布于叶背，叶正面也有分布，子囊果多集生少散生，能产生两种形态的产孢结构，经形态学鉴定为三孢半内生钩丝壳Pleochaeta shiraiana DC.和南芥白粉菌E. acalyphae DC.。分生孢子柱状串生4～7个，大小25.0～40.0×160～20.0 μm;三孢半内生钩丝壳Pleochaeta shiraiana DC.，子囊果聚生至近聚生，少数散生，暗褐色，扁球形，多分布叶正面，直径90-140 μm，壁细胞不规则多角形，直径15～25 μm，附属丝8～15根，至子囊果上部发生，直或弯曲，长度约为子囊果的0.7～1.5倍，长70～155 μm，上下近等粗或下部略粗，子囊4～6个，近球形、广卵形至不规则卵形，大多数无柄，少数有短柄，45～55×30～45 μm，子囊孢子4～6个，大小12～20×10～15 μm（图3b， 3c）;南芥白粉菌E.acalyphae DC.，子囊果聚生至近聚生，少数散生，暗褐色，扁球形，直径85～185μm，壁细胞不规则多角形，直径12～25 μm，附属丝7～15根，至子囊果上部发生，直或稍弯曲，长度约为子囊果的0.5～1倍，长40～175 μm，上下近等粗或下部略粗，子囊2个有时3、4个，卵形、近卵形至不规则卵形，有柄有时亦不见柄，35～55×20～30 μm，子囊孢子5～8个，大小12～23×6～14 μm（图3-D）。

2.3系统发育

构建的系统发育树中可以看出，32个样品经过系统发育树比较后大致分入3支，分别是白粉菌属（Erysiphe）、叉丝单囊壳属（Podosphaera）、布氏白粉菌属（Blumeria），与形态学鉴定结果一致;测定的植物白粉菌均与NCBI里面白粉菌属植物列入一个分枝，但是在白粉菌属分组中，烟草白粉病E.cichoracearum DC.卻被分到另一个分枝，与前面鉴定的酸模叶蓼白粉菌、短序铁苋白粉菌、朴树白粉菌分隔开来，说明形态学鉴定结果在分子水平上基本保持一致，故可以推断烟草白粉菌E.cichoracearum DC.与周边寄主植物其他白粉菌种种间相关性不大，其他白粉菌属的种不太可能交叉感染引起烟草白粉病。考虑到本次采样在其他植物上没有采到菊科白粉菌E.cichoracearum DC.，故应该以不同寄主白粉菌E. cichoracearum DC.与烟草的病原菌想关性作为出发点，采集寄主植物菊科白粉菌

3结论与讨论

据刘铁志等[6]研究表明，有一些植物白粉病存在着多个病原菌，以往所认识的引起烟草白粉病的病菌为E. cichoracearum DC.，但是根据刑荷荷等[9]调查了青岛烟草发现引起烟草白粉病的病原菌为奥隆特高氏白粉菌Golovinomyces orontii，故烟草白粉菌也可能存在着多个病原菌。

COOK等[10]研究介绍，将紫藤和夏栎上分离的白粉菌E. alphitoides接种到夏栎上成功了，但是接种白粉菌到紫藤上均失败告终，BRAUN

和COOK[11]也报道夏栎在世界范围内存在着超过26种白粉菌，故表明白粉菌寄主选择有扩张的趋势。烟草白粉病的控制除了采用抗病品种外，首先就要加强田间管理，烟田杂草的发生严重影响了烤烟的质量和产量，李祖任等人

[7]

于2011年和2012年对贵州省主要烤烟产区进行了杂草调查，共鉴定出杂草191种，隶属于43科132属。而且有研究表明很多杂草已经成为烟草病虫害的寄主和传播媒介，对烟草的生长产生了很大的危害[8]。分子系统学是一种比较直观和简单的反应不同种属亲缘关系的方法，目前已经被广泛应用于真菌分类学中，为了解烟田周边寄主白粉菌与烟草白粉菌的相关性，本文对烟田周边寄主白粉菌进行调查采样，共采集到了寄主植物30种，表明贵阳地区烟田周边白粉菌寄主非常丰富，将采集到的样品进行形态学鉴定及系统发育分析确定烟草白粉菌与寄主白粉菌的相关性，结果表明，形态学鉴定结果基本上与分子鉴定一致，故表明烟草白粉病不是E. cichoracearum DC.菌而是由本属的其他种引起的概率非常低，烟草白粉病与其他种类白粉菌属的种的相关性不大，为了更好确定二者间的相互作用关系，还需进行致病分析及采集引起烟草白粉病的同一种白粉菌进行致病分析和系统发育分析确认，为烟草白粉病发生的预测预报工作制定科学合理的烟田杂草防除策略奠定基础。

参考文献：

[1]张喜萍. 月季白粉病发生规律及初侵染来源初探[J].东北农业大学学报，2003， 34（2）：231233.

[2]吴明藻， 燕嗣皇， 胡贵棋. 小麦白粉菌的越冬越夏及有关生物学特性研究[J].贵州农业科学， 1984（3）：3136.

[3]杨家书，葛泉卿. 东北春麦区小麦白粉菌的侵染循环[J].植物病理学报， 1992， 22（1）： 3540.

[4]陶家凤，文成敬，张敏，等.小麦白粉病对几种禾本科植物侵染的观察[J].四川农业大学学报，1985，3（2）： 18.

[5]郑儒永， 余永年. 中国真菌志-白粉菌目[M].北京：科学出版社， 1987.

[6]刘铁志. 内蒙古白粉菌分类及区系研究[D].呼和浩特：内蒙古大学，2007.

[7]李祖任， 胡楠， 晏升禄， 等. 贵州省烟田杂草名录[J].山地农业生物学报， 2013， 32（4）：314321.

[8]韩云， 殷艳华， 王丽晶， 等. 广东烟田主要杂草类型与不同轮作方式杂草种类调查[J].广东农业科学， 2011（21）：8489.

[9]邢荷荷， 梁晨， 于静， 等. 青岛地区烟草白粉病病原[J].菌物学报， 2015， 34（1）： 159163.

[10]COOK R T A，DENTON J O，DENTON G.Pathology of oak-wisteria powdery mildew[J].Fungal biology ， 2015， 119（8）： 657671.

[11]Braun U， Cook RTA. Taxonomic Manual of the Erysiphales（Powdery Mildews）[M].In：CBS Biodiversity Series11， 2012.