贵阳月季灰霉病病原鉴定及生物学特性

2020-11-09程欢欢任静宋莉莎李忠

山地农业生物学报 2020年2期

程欢欢任静宋莉莎李忠

摘要：月季灰霉病是贵阳市乌当区月季种植区发生最严重的真菌病害之一。本研究采用组织分离法和致病性测定，分离到1株引起该病的病原菌，通过形态学特征观察及RPB2、HSP60、G3PDH多基因序列分析，表明引起该病害的病原菌为灰葡萄孢（Botrytis cinerea）。生物学特性研究表明：该病原菌生长较好的培养基为PDA;菌丝生长最适碳、氮源分别为葡萄糖、硝酸铵;最适生长温度为20 ℃;最适pH为6;光照对病原菌菌丝生长差异显著，其中12 h光暗交替条件下病原菌生长较好。病原菌菌丝致死温度为42 ℃ 10 min。

关键词：月季;灰霉病;灰葡萄孢;鉴定;生物学特性

中图分类号：S68512

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2020）02-0087-06国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2020.02.015

Pathogen identification and biological characteristic of grey mold on Rosa chinensis in Guiyang

CHENG Huanhuan1，REN Jing2，SONG Lisha1，LI Zhong1，3*

（1Agricultural College，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China; 2 Agricultural Bureau of Wudang District，Guiyang City，Guizhou Province，Guiyang，Guizhou 550018，China; 3 Guizhou Key Laboratory of Propagation and Cultivation on Medicinal Plants，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：Grey mold of China rose is the most serious fungal disease of Chinese rose in Wudang District，Guiyang City Tissue isolation and pathogenicity determination were used to isolated a pathogenic strain that caused grey mold Morphological characteristics observation and multi-locus phylogenetic analyses o fRPB2 HSP60 and G3PDH polygenic sequence analysis showed that the pathogen was Botrytis cinereaThe results of biological characteristics of B cinerea showed that PDA was the optimal medium for the growth of the pathogen; the optimal sources of carbon and nitrogen for the growth of hyphae were glucose and ammonium nitrate; the optimum growth temperature was 20 ℃; the optimal pH was 6; the growth of mycelia of pathogenic bacteria was significantly different by light The pathogen grew better under the condition of 12 h alternating light and darkThe lethal temperature for the mycelial of Bcinerea was 42 ℃ for 10 min

Keywords：Rosa chinensis Jacq; grey mold; Botrytis cinerea; identification; biological characteristic

月季（Rosa chinensis Jacq），又名“月月紅”，为常绿、半常绿低矮灌木，是我国传统名花之一[1]，四季均可开花。花色一般为红色和粉色，偶有白色和黄色，既是观赏类植物，也作为药用类植物[2]。因其花色多样，花期较长，株型多变，有较强的生态适应性，在绿化、美化环境、家居装饰等多个领域都有较好的应用前景和较高的观赏价值，是享誉国内外的重要花卉，素有“花中皇后”之称[35]。近年来，贵阳市广泛种植月季，但在种植过程中因气候条件和栽培方式存在差异，导致月季白粉病、灰霉病、霜霉病等主要病害的大量发生而降低花的质量[67]。

灰霉病是月季最常见的病害之一[8]，可导致月季叶片产生褐色斑点，最终叶片褐变枯死，严重的会致使一些枝条甚至整个植株枯死，灰霉病菌的感染严重降低了月季的观赏性和经济价值。本研究在贵阳市乌当区月季种植区采集具有典型月季灰霉病病害的标本，并对其发病花瓣进行病原菌的分离纯化、形态学和分子生物学鉴定及生物学特性测定，为今后研究该病害的流行规律和防治方法提供依据。

1材料与方法

11病害调查及症状观察

2018年10月在贵州省乌当区花园小镇，采集具有月季灰霉病典型症状的植株，观察并记录病害特征。

12病原菌的分離与鉴定

121病原菌分离

采用常规组织分离法[9]，先用清水将病变花瓣洗净，切取发病典型的月季病健交界处5 mm×5 mm 的小块，先用75%的酒精浸润30 s，然后用无菌水冲洗3～4次，无菌操作后将病组织置于PDA上，转至25 ℃培养箱内，培养3 d后进行病原菌的纯化后置4 ℃冰箱保存备用。

122致病性测定

选取健康的月季植株，对花瓣进行消毒处理，打取直径5 mm菌饼于花瓣上，同时以不接菌饼的健康植株作为对照;每处理3次重复，保湿、观察并记录月季花瓣发病情况[10]。

123形态学鉴定

将分离的菌株编号为RJ437，并接种于PDA平板上25 ℃恒温光照培养，观察记录其菌落特征、产孢结构及孢子形态[6];根据菌株RJ437的形态特征初步确定其分类地位。

124分子生物学鉴定

选择真菌DNA提取试剂盒（Biomiga Fungal gDNA Kit）提取供试菌株DNA，对灰霉病病原菌的RPB2、HSP60、G3PDH

基因序列进行扩增（表1）。PCR产物送上海生工公司测序。将测序结果在 NCBI 中进行同源性比对，并进行系统发育分析，其RPB2、HSP60、G3PDH序列已上传至GenBank，其对应登陆号分别为MN566559、MN566560、MN566561。采用 MEGA 6系统发育软件进行多重序列比对后，采用最大简约法[11]进行分析运算，参照马维思等人[12]的研究报道选取21个葡萄孢属菌株（表2），构建基于RPB2、HSP60、G3PDH序列的系统发育树。

13病原菌生物学特性研究

131不同培养基对病原菌菌丝生长的影响

参照袁月等人[13]的研究方法，将直径为5 mm的病原菌菌饼分别接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）、葡萄糖蛋白胨培养基（GPA）、察氏培养基（Czapek）、淀粉琼脂培养基（SA）、清水琼脂培养基（WA）平板中央（d=9 cm），每处理3次重复，20 ℃恒温光照培养，5 d后用十字交叉法测量菌落直径。

132病原菌对碳、氮源的利用

利用Czapek培养基为基础培养基[13]，取病原菌菌饼分别接种至以葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、可溶性淀粉配制成不同碳源的固体培养基中央及以硝酸铵、蛋白胨、尿素、硫酸铵、硝酸钠配制成不同氮源的固体培养基中央，分别置于

20 ℃恒温光照培养。每处理3次重复，5 d后用十字交叉法测量菌落生长直径。

133不同温度对病原菌菌丝生长的影响

取病原菌菌饼至灭菌处理后的PDA培养基平板上，分别置于5、10、15、20、25、30和35共7个温度处理下光照培养。每处理3次重复，5 d后用十字交叉法测量菌落生长直径。

134不同pH值对病原菌菌丝生长的影响

用1 mol/L 的HCL和1 mol/LNaOH缓冲液将灭菌处理后的PDA培养基调节pH值分别为40、50、60、70、80、90和100共7个梯度，将5 mm的菌饼置于已调节好pH值的PDA平板中央。分别置于20℃恒温光照培养，每个处理3次重复。5 d后用十字交叉法测量菌落生长直径。

135光照对病原菌菌丝生长的影响

将病原菌菌饼移至PDA平板中央，在人工气候培养箱内设置24 h连续黑暗、24 h连续光照（40 W日光灯）、12 h光暗交替处理共3种光照条件，分别置于20 ℃恒温培养。每处理3次重复，5 d后用十字交叉法测量菌落生长直径。

136病原菌菌丝致死温度测定

将病原菌菌饼接入规格为15 mm×20 mm灭菌试管中，每管10 mL无菌蒸馏水，每管接入3～5块菌饼，分别将试管置于

30、35、40、45、50、55、60和65 ℃共8个温度处理的恒温水浴锅中水浴10 min，期间缓慢摇动试管使之受热均匀，将处理后的病原菌菌饼置于PDA培养基平板中央，每处理重复3次，20 ℃恒温光照培养5 d，观察菌丝生长情况。视菌丝生长结果采用相同方法，将菌饼分别置于更小温度间隔下进行更精确的测定，每处理3次重复[14]。

2结果与分析

21病害症状

图1所示，该病害主要侵染月季的花、叶片和嫩枝，花萼部最容易受侵染。发病多从花瓣边缘开始，初呈水渍状斑痕，花瓣上出现小斑点，边缘变褐色，后期花瓣变褐色腐烂萎蔫，在高湿条件下很快发展成灰褐色、稍凹陷的不规则病斑，在发病部位表面密生灰色霉层，使病部发生褐色腐烂，枝、茎杆疏水功能丧失、易折断。发病严重时整株死亡。

22致病性测定

图2所示，对月季花瓣部进行致病性测定，接种病原菌的花瓣20 ℃保湿培养48 h后开始表现病状（图2B），5天后花瓣全部变黄褐色枯萎腐烂（图2C），接种发病的花瓣上再次分离得到的菌株与原接种菌株相同，证实了该菌株为致病菌。

23病原菌形态特征

图3所示，在PDA培养基上20 ℃光照培养5 d，病原菌菌落直径可达75～80 cm。菌落初为白色，后期渐变为浅褐色（图3-A、B）。气生菌丝呈放射状，可产生黑色菌核，圆形到长圆形，常交织形成不规则形状，表面覆有菌丝，直径 20～4 2 mm;分生孢子梗较细长、簇生，略带灰色至褐色，顶端分枝，末端膨大近球形，上有小梗，着生大量分生孢子，呈葡萄穗状（图3-C、D）; 分生孢子单胞，椭圆或卵圆形，无色，末端稍突，大小为 63～107 μm× 6 0～92 μm（图3-E、）;结合病害症状、病原形态，将其初步鉴定为灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。

24病原菌的分子生物学鉴定

基于供试菌株的RPB

2、HSP60、G

3PDH基因序列构建联合系统发育树（图4）。菌株RJ437与Botrytis cinerea SAS405聚集成一支，且支持率达100%。能与其它种明显区分开。结合菌株形态学特征，将病原菌RJ437鉴定为灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。

25病原菌生物学特性研究

251培养基对病原菌菌丝生长的影响

表3所示，病原菌在PDA培养基上生长直径最大，其菌落直径为7441 mm;其次为PSA、GPA、SA、Czapek培养基，菌落直径依次为7023 mm、6860 mm、6417 mm、5755 mm;WA培养基最不利于病原菌生长。且菌落直径最小为2386 mm。表明PDA培养基为该菌生长的最适培养基。

252病原菌对碳、氮源的利用

如表4所示，病原菌能利用多种碳源和氮源。在供试碳源中，病原菌20 ℃恒溫光照培养5 d均能生长，对葡萄糖利用最好，菌落直径为7356 mm;其次为果糖，菌落直径为6847 mm;蔗糖和麦芽糖对菌丝生长的影响无明显差异（4968 mm、4633 mm）;病原菌对可溶性淀粉的利用最差，菌落直径为3583 mm。在氮源的利用试验中，病原菌对硝酸铵的利用最好，菌落直径为7500 mm;其次为硫酸铵和硝酸钠，菌落直径分别为6653 mm和6285 mm;对蛋白胨的利用效果次于硫酸铵，菌落直径为4363 mm;对尿素的利用效果最差，菌落直径为1916 mm。

253不同温度对病原菌菌丝生长的影响

表5所示，在10～30 ℃灰葡萄孢菌丝均可生长，最适温度为20 ℃，菌落直径为7340 mm。其次为25 ℃和15 ℃时，菌落直径分别为6516 mm、5950 mm;不同温度条件下菌落扩展的速度不同，培养温度较低（10 ℃以下）时

，生长慢甚至不生长;培养温度较高（30 ℃）时，生长菌丝长势弱，生长速度慢，生长直径为953 mm。灰葡萄孢菌落初期为白色，在温度不适宜时，培养基基部会出现黑色小菌核，菌落生长缓慢且菌落很快变为灰褐色。

254不同pH值对病原菌菌丝生长的影响

如表6所示，菌株在pH 4～10范围内均可生长，不同pH值下的菌落生长情况明显不同。5 d时pH值为6的处理菌落生长势较为明显，其菌落直径为7225 mm，其次为pH值5和7，其菌落直径分别为6613 mm、5933 mm，pH值4、8、9、10次之，其菌落直径分别为4673 mm、4152 mm、2776 mm、850 mm，说明灰霉病菌对在不同pH值条件下的适应性较强。

255不同光照对病原菌菌丝生长的影响

表7所示，病原菌在24 h持续光照、24 h持续黑暗、12 h光暗交替处理条件下，菌落平均直径分别为7213、6742、

7657 mm。其中光暗交替（12 h光照/12 h黑暗）处理的菌落直径最大，这说明光暗交替处理为病原菌最适光照条件。

256病原菌菌丝致死温度

病原菌在水温30～40 ℃经10 min处理的菌饼在PDA培养基上均能继续生长，但在45～65 ℃ 10 min处理的菌丝不再生长。然后将菌块分别置于40～45 ℃的恒温水浴处理10 min （温度梯度为1 ℃），表明该菌菌丝的致死温度是42 ℃、10 min。

3结论与讨论

本研究从月季花瓣中分离获得菌株RJ437，通过对其进行致病性测定和形态学特征及RPB2、HSP60、G3PDH联合基因序列分析，将引起贵阳市乌当区月季灰霉病的病原菌鉴定为灰葡萄孢（Botrytis cinerea）。灰葡萄孢（B cinerea）是一种较为常见的病原菌，可引起多种观赏植物的灰霉病病害，如张蕾等[15]报道的灰葡萄孢可引起仙客来的灰霉病;杜艳丽等[16]报道的灰葡萄孢可引起百合的灰霉病，与本研究引起月季灰霉病的病原菌结果一致。目前，国内关于月季的研究报道在栽培技术、观赏性状及病害的调查防治等方面较多[1719]，而针对贵阳市引起月季灰霉病病原菌的鉴定及生物学特性的研究未见报道。

生物学特性研究结果表明：月季灰霉病的病原菌灰葡萄孢（Bcinerea）生长最适培养基为PDA培养基;最适碳氮源分别为葡萄糖和硝酸铵;菌丝生长最适温度为20 ℃，最适pH值为6;不同光照处理对病原菌菌丝生长的影响差异显著，12 h光暗交替处理为病原菌最适光照条件，菌丝体致死温度是42 ℃10 min。卢燕回等[20]研究报道的烟草灰霉病致病菌灰葡萄孢的最适碳源为葡萄糖，最适生长温度为20 ℃，最适pH为6;戴启东[21]报道的蓝莓灰霉病致病菌灰葡萄孢的最适氮源为硝酸铵，最适生长温度为20 ℃，最适pH为6;与本试验的结论基本一致。杜艳丽等[16]报道的百合灰霉病病原菌灰葡萄孢的适培养基为PSA培养基，最适氮源为牛肉膏;李聪丽等[22]报道的香葱灰霉病病原菌灰葡萄孢最适碳氮源分别为可溶性淀粉、酵母粉，菌丝致死温度是52 ℃（10 min） ;与本研究结果不一致，可能与寄主、地区气候海拔等因素不同以及选择的供试碳氮源不同而存在差异。

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