王蕾蕾 华姞安 孟靓 魏益谦 孟智睿 贾岚 高学敏 王景霞

青钱柳Cyclocaryapaliurus是中国特有的珍稀树种资源，《中国中药资源志要》中记载青钱柳叶具有“清热解毒，生津止渴”的功效。研究发现，青钱柳叶具有降血糖、降血脂、抗氧化等作用[1-2]。糖尿病属于中医“消渴病”的范畴，具有阴虚为本，内热为标的病机特点，临床常使用药性寒凉的养阴生津药物治疗。课题组的前期研究显示青钱柳叶对2型糖尿病大鼠具有显著的降血糖作用，可以调节胰岛素的分泌，抑制氧化应激对组织器官结构的影响[3-5]，能够缓解高血糖大鼠早期肾损伤，具有调节肾损伤标志物的作用[6]。本实验在前期研究的基础上，采用高脂饲料喂养结合皮下注射甲状腺素及一次性腹腔注射小剂量链脲佐菌素 (streptozotocin，STZ)诱导建立阴虚证型2型糖尿病大鼠的病证结合动物模型[7]，探讨青钱柳叶对阴虚型2型糖尿病大鼠证侯指标及糖脂代谢的影响，为进一步深入研究青钱柳的功效和药性特点奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，8周龄，体重在180～200 g。购买于斯贝福(北京)动物科技有限公司，实验动物许可证号：(SCXK(京)2016-0002)。实验动物饲养在北京中医药大学屏障环境动物实验室。高脂饲料配方中每100 g高脂饲料中含有：10 g猪油、15 g蔗糖、15 g蛋黄粉、5 g酪蛋白、1.2 g胆固醇、0.2 g胆酸钠、0.6 g碳酸氢钙、0.4 g石粉、52.6 g普通饲料，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。

1.2 实验药物与试剂

实验药物：青钱柳叶水提物干膏(无限极中国有限公司提供本研究用)，制备方法：5 kg原料，第一次加12倍水，煮沸保持微沸2小时，过滤，滤渣再加10倍水，煮沸保持微沸1小时，过滤合并2次滤液，浓缩干燥成干膏，粉碎过80目筛，干燥保存待用。知柏地黄丸(九芝堂股份有限公司，360丸/瓶)。

实验试剂：链尿佐菌素(streptozotocin，SIGMA公司，批号：WXBC3087V)，柠檬酸钠缓冲液(索莱宝公司，批号：20180830)，L-甲状腺素钠(北京百诺威生物科技有限公司，批号：20190320)，总胆固醇试剂盒(TC，批号：20190320)，甘油三酯试剂盒(TG，批号：20190320)，高密度脂蛋白试剂盒(HDL批号：20190320)，低密度脂蛋白试剂盒(LDL，批号：20190320)，游离胰岛素试剂盒(FINS，批号：20190320)，三碘甲状腺原氨酸试剂盒(T3，批号：20190320)，甲状腺素试剂盒(T4，批号：20190320)，环磷酸腺苷试剂盒(cAMP，批号：20190320)，环磷酸鸟苷试剂盒(cGMP，批号：20190320)，以上试剂盒购买于北京华英生物技术研究所。

1.3 实验仪器

电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，PL-203)，超声细胞粉碎机(宁波新芝生物，JY92-IIn)，台式高速冷冻离心机(Heal Force，Neofuge 15R)，纯水仪(青岛富勒姆科技，FBZ2001-UP-P)，涡旋混合器(Servicebio，MX-F)，超低温冰箱(海尔，DW-86L626)，全自动生化分析仪(深圳雷杜生命科技，Chemray 240)，全自动研磨仪(武汉赛维尔生物有限公司，KH-III)，酶标检测仪(BioTeK，Epoch)，自动洗板机(Rayto，RT3100)，稳豪倍易型血糖仪和血糖试纸(强生上海医疗器械有限公司)。

1.4 动物造模、分组及给药

雄性SD大鼠60只，先适应性喂养1周，将大鼠随机分为空白组7只和造模组53只。其中空白组给予普通饲料，造模组高脂饲料喂养8周。第9周，以0.2 mg/kg的剂量皮下注射甲状腺素溶液1周，造模组以30 mg/kg的剂量一次性腹腔注射2%的STZ溶液(现用现配，取适量STZ，锡纸避光于冰块之中避光保存，用0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液在冰浴中配置溶液，pH=4.5)，并于72小时后禁食不禁水8小时，尾尖静脉取血测FBG >11.1 mmol/L为造模成功，注射STZ后，大鼠死亡3只，成模40只，随机取成模大鼠7只，空白大鼠7只，计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR)、胰岛素作用指数(insulin action index，IAI)。剔除空腹血糖>30 mmol/L的大鼠5只，选择35只成模大鼠纳入实验。随机分为模型组，知柏地黄丸组，CPE低、中、高剂量组，每组纳入7只成模大鼠。

根据10 mL/kg给药体积计算，空白组和模型组大鼠灌胃无菌水，知柏地黄丸组给药剂量为0.3 g/kg，青钱柳叶水提物(CPE)低、中、高剂量组按干膏灌胃剂量分0.25、0.5、1 g/kg，连续给药4周。在给药期间，全组大鼠喂食普通饲料，自由进食和饮水。

1.5 血液样品的制备与指标检测

开始给药后，每间隔1周禁食(自由饮水)8小时，尾静脉采血检测空腹血糖(FBG)，称重记录体重变化。给药4周后，禁食不禁水8小时，先灌胃CPE，30分钟后，尾尖静脉取血测定灌胃葡萄糖后0小时血糖，灌胃葡萄糖溶液(2.0 g/kg)，测定灌胃葡萄糖后0.5 小时、2 小时的血糖值，计算血糖曲线下面积。血糖曲线下面积(AUC)计算公式如下：1/2×(0小时的血糖值+0.5 小时的血糖值)×0.5+1/2×(2 小时的血糖值+0.5 小时的血糖值)×1.5；采用酶免法测FINS含量，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、胰岛素作用指数(IAI)。HOMA-IR：FINS/22.5e-lnFBG ≈(FBG×FINS)/22.5，IAI:LN(1/HOMA-IR)。实验结束后，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，经由腹主动脉采血，冷冻离心分离血清，检测T3、T4、cAMP、cGMP的含量。

1.6 统计学处理

2 实验结果

2.1 一般状态观察

实验期间观察大鼠的状态，皮下注射T4一周后，情绪急躁，有声响即抬头，活动增加，毛发枯黄，易脱落，饮水量、进食量增加，舌红，唇红，爪淡红，小便黄，大便干。注射STZ后，情绪急躁，有声响即抬头，好动撕咬，毛发枯黄，无光泽，易脱落，饮水量、饮食量显著增加，舌色鲜红，唇色暗红，爪色红，小便多，大便干，色黑，出现阴虚的证候表现。在给药后，模型大鼠毛发恢复光泽，脱落减少，自主活动正常，舌色红，唇红，爪色淡红，大便干色黑。

2.2 CPE对阴虚型T2D大鼠体重的影响

与空白组进行比较，模型组大鼠体重显著降低(P<0.01)。与模型组进行比较，知柏地黄丸组大鼠第1周至第4周体重显著增加(P<0.01)，CPE高剂量组体重显著增加(P<0.01)，见表1。

表1 青钱柳对阴虚型T2D大鼠体重的影响

2.3 CPE对阴虚型T2D大鼠FBG的影响

与空白组进行比较，模型组大鼠FBG值第1周至第4周显著地升高(P<0.01)。与模型组进行比较，知柏地黄丸组第1周至第4周FBG显著降低(P<0.01)；第1周CPE中、高剂量组FBG显著降低(P<0.01)，第2周CPE低、高剂量组FBG显著降低(P<0.05，P<0.01)，第3周CPE低、中、高剂量组FBG显著降低(P<0.05，P<0.01)，第4周CPE高剂量组FBG显著降低(P<0.01)，见表2。

表2 青钱柳对阴虚型T2D大鼠FBG的影响

2.4 CPE对阴虚型T2D大鼠糖耐量的影响

与空白组进行比较，模型组0 小时、0.5小时、2小时血糖，AUC显著升高(P<0.01)。与模型组进行比较，知柏地黄丸组0 小时、2 小时血糖，AUC显著降低(P<0.01)；CPE高剂量组AUC显著下降(P<0.01)，见表3。

表3 青钱柳对阴虚型T2D大鼠糖耐量的影响

2.5 CPE对阴虚型T2D大鼠FINS、HOMA-IR、IAI的影响

与空白组进行比较，模型组的FINS、HOMA-IR显著升高(P<0.01)，IAI显著下降(P<0.01)。与模型组进行比较，知柏地黄丸组的HOMA-IR显著下降(P<0.01)，IAI显著升高(P<0.01)；CPE低、高剂量组HOMA-IR降低(P<0.05)；CPE低、高剂量组IAI显著升高(P<0.05，P<0.01)。见表4。

表4 青钱柳对阴虚型T2D大鼠FINS、HOMA-IR、IAI的影响

2.6 CPE对阴虚型T2D大鼠血脂的影响

与空白组进行比较，模型组大鼠血清中TC、TG、LDL显著地升高，HDL明显地降低(P<0.05，P<0.01)；与模型组进行比较，知柏地黄丸组TG、LDL显著下降(P<0.01)；CPE中剂量组血清LDL显著下降(P<0.01),CPE高剂量组血清TC、TG、LDL显著下降(P<0.01，P<0.05)，CPE低、中、高剂量组HDL有升高的趋势，但各组间的差异没有统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 青钱柳对阴虚型T2D大鼠血脂的影响

2.7 CPE对阴虚型T2D大鼠的T3、T4、cAMP、cGMP的影响

造模后与空白组进行比较，模型组大鼠血清中T3、T4、cAMP、cGMP的含量显著地升高(P<0.01，P<0.05)；与模型组比较，知柏地黄丸组T3、T4、cAMP、cGMP显著下降(P<0.01,P<0.05)；CPE低、高剂量组血清中T3、T4显著下降(P<0.01,P<0.05)，CPE低、中、高剂量组血清cAMP、cGMP显著下降(P<0.01)。见表6。

表6 青钱柳对阴虚型T2D大鼠的T3、T4、cAMP、cGMP的影响

3 讨论

中医的阴虚证侯主要表现为五心烦热，咽干颧红，形体消瘦，小便短黄或大便干结，舌红少津等症状。采用大剂量甲状腺素激素注射，可使大鼠表现出好动，易怒，毛发枯槁，饮水量和进食量增加，体重下降，小便黄，大便干结等症状，与临床上肾阴虚患者的症状相似，能很好地模拟阴虚的证候表现[8]。故本实验采用高脂饲料喂养大鼠8周后，皮下注射甲状腺素溶液1周，再结合一次性腹腔注射小剂量STZ诱导建立阴虚证型2型糖尿病大鼠的病证结合动物模型。

T3、T4作为下丘脑-垂体-甲状腺轴中甲状腺分泌的关键激素，调节机体产热的功能，同时还有调控机体能量代谢的作用[9]。近年有研究表明T3、T4可能是阴虚证型的证候指标，阴虚患者血清中的T3、T4明显升高[10]。有研究认为T3、T4可以作为糖尿病阴虚内热证的证候观察指标[11]。cAMP、cGMP作为“第二信使”参与细胞内能量的代谢，调控能量代谢信号的正常传递，是机体内能量代谢的重要标志[12]。研究显示虚热证模型大鼠血清中cAMP、cGMP都显著地升高，其可能是阴虚与阳虚的证候标志[13]。

在本实验中，与空白组进行比较，模型组大鼠出现多饮、多食、多尿“三多一少”的症状，还出现了情绪急躁，有声响即抬头，撕咬好动，毛发枯黄，无光泽，易脱落，体重下降，舌色鲜红，唇色暗红，爪色红，大便干，色黑等症状，T3、T4、cAMP、cGMP显著升高，说明模型大鼠的阴虚证候表现明显；空腹血糖、HOMA-IR明显升高，IAI下降，说明模型大鼠机体内存在胰岛素抵抗，血脂四项也出现异常，结合文献报道[7, 14]，提示阴虚型2型糖尿病病证结合模型造模成功。

给予青钱柳叶水提物治疗后，模型大鼠体重逐渐增加，毛色恢复光泽，毛发脱落减少，情绪较为稳定，阴虚证侯表证得到一定的缓解。血糖动态监测显示青钱柳叶水提物能够稳定地控制血糖，而且青钱柳叶不仅能降低HOMA-IR指数，提高IAI指数，有效缓解胰岛素抵抗，同时可使实验大鼠的TG、TC、LDL显著降低，HDL有升高的趋势。以上实验结果提示，青钱柳叶可降低阴虚型2型糖尿病大鼠的空腹血糖，缓解胰岛素抵抗，调节血脂代谢紊乱。但是青钱柳缓解阴虚证侯表证，调节甲状腺激素和环核苷酸的作用以及调节糖脂代谢的作用，是各自独立的通路，还是存在着一定的联系尚不明确，还需要进一步深入的研究。