王慧慧 ,苏川芬 ,荆 旭 ,毕昕媛 ,王晓闻∗

(1.山西农业大学食品科学与工程学院,太谷 030801; 2.山西农业大学农业资源与经济研究所,太原 030006)

链霉素是从链霉菌中分离得到的一种氨基糖苷类抗生素,对多种革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌有较强的抗菌活性,广泛应用于医疗保健行业、食品生产行业和畜牧业[1]。然而,抗生素的不合理使用会导致其残留于动物体内,并通过食物链富集进入人体从而造成不良影响。目前,链霉素的常用测定方法包括色谱法[2]、化学发光法[3]、免疫分析法[4]、分光光度法[5]、微生物法[6]和共振瑞利散射法[7]。虽然上述测定方法具有较高的准确度和灵敏度,但也存在着一些局限性,如仪器昂贵、测定时间长、样品制备过程复杂、需要专业的操作人员[8]等。因此,需要建立一种简单、经济、快速、便携的测定链霉素的方法。

纳米材料具有表面易改性、比表面积大等优异的物理和化学性质,在多个领域引起了广泛的关注[9]。以金属纳米粒子为基础的纳米测定技术具有高选择性、高灵敏度,克服了传统测定方法中存在的一些问题,得到了广泛的应用。虽然金属纳米粒子的化学合成方法多种多样,但其中许多化学合成方法是有毒的,具有潜在的危险。相比之下,基于天然生物材料合成金属纳米粒子是一种环保的方法。近些年来,一些研究小组已经使用从单细胞生物中提取的细菌[10]和真菌以及植物部位的提取物,如天竺葵叶、柠檬草[11]和印楝叶[12]等,成功地合成了银、金、铅纳米粒子。但利用天然生物材料合成银纳米粒子的研究还不多。与其他贵金属纳米粒子相比,银纳米粒子具有高的消光系数、清晰的消光带、高的散射消光比和极高的电场强度[13],已经成为一种在比色传感系统中可以替代金纳米粒子的纳米材料。在传感过程中,银纳米粒子在一些特定的离子或抗生素的存在下呈现出肉眼可见的颜色变化,通过颜色的变化来确定目标物的化学成分及含量。因为局域表面等离子体共振效应对银纳米粒子的组成、大小和形状高度敏感,所以银纳米粒子具有显著的响应视觉颜色变化能力,因此它可以作为强大的光学传感器。近年来,银纳米粒子已用于重金属离子[14]、蛋白质[15]、脱氧核糖核酸(DNA)[16]、生物药物[17]、细菌[18]等的测定。

随着科技的发展,智能手机拥有强大的处理器、高清显示触摸屏、高像素摄像头、无线传输模块和各种传感器元件。而且,智能手机越来越小型化、完善化、自动化和智能化,已成为一种潜在的便携分析设备[18-20]。智能手机能够分析试验结果、增强信号、与其他设备共享或传输数据,是一种带有数字平台的便携式设备。因此,可以将高度灵敏的纳米技术与高效便捷的智能手机相结合,创建一种智能的纳米生物传感器。

本工作利用天然产物槲皮素和硝酸银合成一种稳定的银纳米粒子。合成的银纳米粒子能够特异性地识别链霉素,溶液颜色由黄色变为樱桃红色,由智能手机记录结果并进行数据分析。本工作通过纳米技术与智能手机相结合,将生物信号转换为可读信号,利用智能手机的数字化处理功能,依据红(R)绿(G)蓝(B)模型对试验结果进行分析,根据显色程度实现了牛奶中链霉素残留量的快速测定,本方法具有速率快、成本低、选择性好、绿色环保等优点。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Cary 60 型紫外分光光度计;ST 3100 型p H计;iPhone 5S型智能手机。

链霉素标准储备溶液:1 mmol·L－1,称取硫酸链霉素标准品0.072 9 mg于50 mL容量瓶中,用适量水溶解并稀释至刻度,于4 ℃冰箱中保存,备用。使用时用水稀释至所需浓度。

槲皮素的纯度不小于98.5%;所用试剂均为分析纯;试验用水为二级蒸馏水。

1.2 试验方法

1.2.1 银纳米粒子的合成

将100 μmol·L－1硝酸银溶液(40 mL)与100μmol·L－1槲皮素溶液(10 mL)按体积比4∶1置于100 mL的烧杯中。然后将烧杯置于磁力搅拌器上于恒温(50 ℃)下搅拌5 min,再逐滴加入15 mmol·L－1碳酸钠溶液1 mL,搅拌几分钟后上述混合溶液由无色变为黄色,并且随搅拌时间的延长逐渐变暗,继续搅拌1 h后,最终合成了槲皮素包覆的银纳米粒子。用1 mol·L－1盐酸溶液或1 mol·L－1氢氧化钠溶液调节上述溶液pH 至7.5,避光保存备用。

1.2.2 样品预处理

移取5 mL牛奶样品置于10 mL 离心管中,加入1 mol·L－1亚铁氰化钾溶液100μL 混匀,然后加入0.25 mol·L－1乙酸锌溶液100μL 混匀,以5 000 r·min－1转速离心5 min,去除蛋白质等杂质。上清液过滤膜(0.22μm)后,于冰箱(－4 ℃)保存备用。

1.2.3 链霉素的测定

移取1 mL合成的银纳米溶液于1.5 mL 的玻璃瓶中,加入10μL 牛奶样品滤液。裸眼观察溶液的颜色,颜色稳定后用iPhone 5S的高分辨率摄像头对上述试验结果进行拍照。使用手机上安装的应用程序(取色器)获取有效区域相对应的RGB 值,计算G/B值。

2 结果与讨论

2.1 槲皮素包覆的银纳米粒子的合成机理

槲皮素(3,3′,4′,5,7-五羟基黄酮,Qt)是拥有多种生物活性的一种黄酮醇类化合物,它具有较高的超离域度、完整的大π键共轭体系、强配位氧原子和独特的空间构型,可作为金属离子的良好空间配体。在合成银纳米粒子的过程中,首先硝酸银在加热的条件下形成银单质,然后槲皮素分子的－OH和C＝O 与银单质相互作用从而形成槲皮素包覆的银纳米粒子。加入碳酸钠溶液后,槲皮素分子因其3-OH 和4′-OH 这2个羟基在碱性溶液中不稳定,易开环转变为查耳酮型,从而使得溶液颜色由无色转变为黄色,并且在不断搅拌的过程中,溶液与空气较长时间接触,使得颜色加深,最终形成稳定的槲皮素包覆的银纳米粒子。

2.2 紫外-可见吸收光谱

100μmol·L－1槲皮素-15 mmol·L－1碳酸钠的混合液、银纳米溶液、100μmol·L－1槲皮素溶液、100μmol·L－1硝酸银溶液和15 mmol·L－1碳酸钠溶液等5种反应体系的紫外-可见吸收光谱见图1。

图1 5种反应体系的紫外-可见吸收光谱Fig.1 UV-Vis absorption spectra of the 5 reaction systems

由图1可知:只有硝酸银与槲皮素混合后且加入一定量的碳酸钠溶液搅拌一段时间后,在波长410 nm 处才出现了银纳米粒子的特征吸收峰,且裸眼观察为黄色,这是因为银纳米比色探针存在表面等离子体共振效应[21]。

链霉素加入前后银纳米溶液的紫外-可见吸收光谱和照片见图2。

图2 链霉素加入前后银纳米溶液的紫外-可见吸收光谱和照片Fig.2 UV-Vis absorption spectra and photograph of silver nanoparticle solution before and after adding streptomycin

由图2可知:加入链霉素之后,波长410 nm 处的吸光度明显降低,波长550 nm 处的吸收峰显著增强。这是由于在槲皮素包覆的银纳米溶液中加入链霉素后,链霉素中的－OH 和－NH2与槲皮素中的－OH 通过氢键作用形成网状结构,导致银纳米粒子的聚集,使溶液由黄色变为樱桃红色[22]。这说明了合成的银纳米粒子对链霉素比色测定的适用性。

2.3 反应条件的选择

2.3.1 硝酸银和槲皮素的用量之比

将100μmol·L－1硝酸银溶液和100μmol·L－1槲皮素溶液分别按体积比2∶1,3∶1,4∶1,5∶1混合,按试验方法合成银纳米粒子,用iPhone 5S智能手机分别拍摄每个体积比下合成的银纳米溶液的照片。由RGB模型处理得到的G/B值和银纳米溶液的照片见图3。

图3 硝酸银和槲皮素的用量之比对银纳米溶液的G/B值和照片的影响Fig.3 Effect of ratio of Ag NO3 to Qt on G/B value and photograph of silver nanoparticle solution

由图3可知:随着100μmol·L－1硝酸银溶液和100μmol·L－1槲皮素溶液的体积比的增加,槲皮素包覆的银纳米粒子的颜色由无色逐渐变成淡黄色,G/B值逐渐变大;当100μmol·L－1硝酸银溶液和100μmol·L－1槲皮素溶液的体积比为4∶1时,槲皮素包覆的银纳米粒子的颜色最深,G/B 值最大,说明此时合成的银纳米粒子吸光度最大;继续增加100μmol·L－1硝酸银溶液和100μmol·L－1槲皮素溶液的体积比时,槲皮素包覆的银纳米粒子的颜色由淡黄色变成无色,G/B 值降低,这可能是由于银离子的聚集使得银纳米粒子的合成减少导致吸光度减小。试验选择100μmol·L－1硝酸银溶液和100μmol·L－1槲皮素溶液的体积比为4∶1来制备槲皮素包覆的银纳米粒子。

2.3.2 反应体系的酸度

合成的银纳米溶液在不同的酸度下颜色不同,用1 mol·L－1盐酸溶液或1 mol·L－1氢氧化钠溶液调节银纳米溶液的酸度,用智能手机拍摄得到调整酸度后的银纳米溶液的照片。银纳米溶液的酸度会对链霉素的测定结果造成影响,不同酸度的银纳米溶液加入链霉素后,反应体系出现的颜色不同。链霉素加入前后银纳米溶液的照片见图4。

图4 链霉素加入前后银纳米溶液的照片Fig.4 Photographs of silver nanoparticle solution before and after adding streptomycin

由图4可知:pH 为2.0时,在强酸性环境下,银纳米溶液的颜色为无色,这可能是因为槲皮素在酸性条件下闭环,从而恢复完整的黄酮醇结构,使溶液颜色由黄色变为无色;随着pH 的升高,银纳米溶液的颜色逐渐变深;加入链霉素后,随着pH 的升高,反应体系的颜色由无色逐渐转变为樱桃红色;p H为7.5时,反应体系的颜色变化最明显,反应体系为樱桃红色;继续升高p H,反应体系的颜色逐渐变淡;pH 为10时,反应体系为淡黄色。

链霉素加入前后银纳米溶液的G/B值见图5。

图5 链霉素加入前后银纳米溶液的G/B值Fig.5 G/B values of silver nanoparticle solution before and after adding streptomycin

由图5可知:pH 为2.0时,银纳米溶液的G/B值最小;继续升高p H,银纳米溶液的G/B值逐渐增大;pH 为7.0时,银纳米溶液的G/B 值最大;继续升高p H,银纳米溶液的G/B 值逐渐趋于平稳。这表明:随pH 的增加,银纳米溶液的G/B值、颜色在pH 为7.0时趋于稳定。加入链霉素后,随着pH 的升高,反应体系的G/B 值先是较平稳,然后逐渐升高。为了准确衡量反应体系的酸度对链霉素测定的影响,用未加入链霉素时银纳米溶液的G/B值与加入链霉素后银纳米溶液的G/B 值的差值Δ(G/B)表示最终的试验结果。Δ(G/B)越大,说明反应体系颜色变化越大。

反应体系的酸度对Δ(G/B)的影响见图6。

图6 反应体系的酸度对Δ(G/B)的影响Fig.6 Effect of acidity of reaction system onΔ(G/B)

由图6 可知:随着pH 的升高,反应体系的Δ(G/B)逐渐增大;pH 为7.5时,反应体系的Δ(G/B)最大;pH 大于7.5时,反应体系的Δ(G/B)显著降低。这说明银纳米溶液的碱性越强,加入链霉素后反应体系颜色的变化程度不明显,特别是在p H为10时,裸眼观察(图4)即可知加入链霉素后银纳米溶液颜色与加链霉素前银纳米溶液的颜色相差不大。可能是银纳米溶液在碱性条件下稳定,而链霉素在强碱性条件下易水解失效,导致溶液颜色不发生改变。试验选择反应体系的酸度为pH 7.5。

2.4 干扰试验

为了验证方法的特异性,试验考察了不同种类的抗生素对链霉素测定结果的影响。分别将链霉素(a)、氟苯尼考(b)、氯霉素(c)、红霉素(d)、氟康唑(e)和头孢噻呋(f)以相同的浓度(100.00μmol·L－1)添加到银纳米溶液(A)中,抗生素加入前后银纳米溶液的照片见图7。

图7 抗生素加入前后银纳米溶液的照片Fig.7 Photographs of silver nanoparticle solution before and after adding antibiotics

由图7可知:氟苯尼考、氯霉素、红霉素、氟康唑和头孢噻呋对链霉素的测定无显著性干扰。这表明槲皮素包覆的银纳米粒子对链霉素有较高的特异性。

2.5 标准曲线、检出限和测定下限

按试验方法对10.00,30.00,50.00,70.00,90.00,110.00,130.00,150.00μmol·L－1的链霉素标准溶液系列进行测定,以链霉素的浓度为横坐标,对应的G/B值为纵坐标绘制标准曲线。结果表明:链霉素的浓度在10.00～150.00μmol·L－1内与其对应的G/B 值呈线性关系,线性回归方程为y＝－1.800×10－3x＋1.266,相关系数为－0.998 7。

以3倍标准偏差除以标准曲线斜率计算方法的检出限(3s/k),结果为0.63μmol·L－1;以10倍标准偏差除以标准曲线斜率计算方法的测定下限(10s/k)[23],结果为2.08μmol·L－1。

2.6 样品分析

按试验方法对市售的纯牛奶样品进行分析,在纯牛奶样品中未检出链霉素。对纯牛奶样品进行加标回收试验,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),并与紫外分光光度法[24]结果进行对比。样品分析结果见表1。

表1 样品分析结果(n＝6)Tab.1 Analytical results of the samples(n＝6)

由表1可知:回收率为97.9%～102%,RSD 为0.90%～2.8%;本方法的测定值与紫外分光光度法[24]的测定结果相一致。

本方法准确可靠,可用于实际牛奶样品中链霉素残留量的测定。

2.7 方法对比

本方法与其他文献报道的链霉素测定方法的对比见表2。

表2 测定链霉素的不同方法的对比Tab.2 Comparison of different methods for streptomycin determination

本工作开发了一种槲皮素包覆的银纳米粒子测定链霉素残留量的方法。方法中采用天然绿色、安全可靠的植物提取物合成银纳米粒子,并对合成的银纳米粒子进行了表征。在最优的测定条件下,合成的银纳米粒子对链霉素表现出高度灵敏性和适用性。结合智能手机的高分辨率摄像头及应用程序捕获的RGB值,方法对试验结果进行分析,实现了链霉素的便携式测定。方法已成功用于测定牛奶样品中链霉素的残留量。本工作提供了一种简单、快速、有效、绿色环保的测定牛奶中链霉素残留量的方法,也为智能手机在食品安全应用程序的开发中提供了理论基础,具有广阔的应用前景。