生化法处理后的链霉素废水出水对斑马鱼SOD活性和MDA含量的影响

2015-09-10赵月曹志会王冰等

江苏农业科学 2015年8期

赵月+曹志会+王冰等

摘要：采用暴露试验方法，研究了10%、20%、30%、40%体积百分比的生化法处理后的链霉素生产废水出水15 d 内对斑马鱼肌肉组织超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量的影响。结果显示，斑马鱼肌肉组织SOD活性、MDA含量在暴露过程中以诱导为主，经过生化法处理后的链霉素生产废水出水比例达到10%时就可以对斑马鱼产生氧化损伤效应，但是比例达到40%时其对斑马鱼的氧化损伤程度并未超过其抗氧化防御系统的阈值，斑马鱼的抗氧化防御系统最终达到了新的平衡，说明鱼体抗氧化防御系统具有自我调节的功能。此外，斑马鱼SOD活性、MDA含量均对链霉素生产废水的胁迫有应激反应，两者有协同性，但是SOD活性比MDA含量更敏感。

关键词：链霉素；斑马鱼；抗氧化防御系统

中图分类号： X703 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）08-0348-03

随着工业的发展，工业废水排放对水生态系统、人类健康构成了巨大威胁，同时给环境风险评估和管理带来了挑战 [1]。目前我国工业废水排放的监督管理以理化监测为主，能快速定量测定某些废水中的污染物含量，但对于组分复杂的工业废水，难以用理化分析方法阐明其组分。因此，建议采用水生生物毒性试验来反映废水的综合毒性 [2-3]。制药企业污水处理厂、城市污水处理厂的污水处理工艺对制药废水中的污染物质去除仍不够彻底 [4]。王丽萍等利用鲤鱼、鲫鱼对污水处理厂废水的急性毒性进行了检测，结果表明，鲤鱼对水质毒性的敏感性高于鲫鱼，出水对鱼的毒性主要是由水中游离氨引起的 [5]。李丽君等用斑马鱼检测几家工业污染源废水毒性，对各行业废水的毒性、污水处理的效果以及污水的综合毒性进行了客观评价，结果显示，大部分行业的工业废水经处理后仍具有毒性 [4]。沈洪艳等采用暴露试验法研究了青霉素、土霉素混合废水的出水不同暴露浓度对斑马鱼肌肉超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量的影响，结果表明，该废水对斑马鱼机体造成了一定的氧化损伤 [6]。锦鲤长期暴露于链霉素废水中会对其抗氧化防御系统及抗氧化能力产生影响 [7]。斑马鱼是国际标准组织推荐的试验用鱼，斑马鱼成鱼个体比其他鱼种小，便于在实验室饲养，具有繁殖能力强、价格便宜等特点，被广泛应用于胚胎发育生物学研究、动物学基因表达研究、毒物在生物体内残留累积效应研究、污染物对于鱼类急性毒性研究等 [8-9]。本研究选取某大型链霉素生产企业污水处理厂生化法处理后的二沉池出水为水样（以下简称链霉素废水出水），以斑马鱼为研究对象，评估链霉素废水出水对鱼体肌肉组织SOD活性、MDA含量的影响，旨在为评价制药工业废水处理工艺有效性以及处理后出水的生态安全性提供依据。

1 材料与方法

1 1 仪器和试剂

UV-2550型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）、DK-S26 型恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）、TG16-WS 台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、JPBJ-608型便携式溶解氧测定仪（上海精密科学与仪器有限公司）、EL204型电子分析天平（梅特勒-上海托利多有限公司）、FE20型pH计（梅特勒-上海托利多有限公司）、XK96-B型快速混匀器（姜堰新康医疗器械有限公司）、BBC-226STV海尔家用冰箱、SYZ-A型石英高纯水蒸馏器（金坛市宏华仪器厂）、WAD-TH型硬度计、手动式匀浆器、温度计、加热棒、移液管等。试验用SOD、MDA、考马斯亮蓝试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，醋酸、乙醇、生理盐水均购自天津永大化学试剂公司。

1 2 受试生物

选用斑马鱼为受试生物，由河北省石家庄市水产养殖基地提供，体长为（34 05±0 43） mm，体质量为（0 24±0 03） g，鱼苗经5%食盐水消毒后进入实验室，用 48 h 曝气的脱氯自来水在实验室驯养7 d用于试验，试验水质符合渔业水质标准，驯养期间斑马鱼死亡率<4%。为防止饵料产生影响，试验前24 h停止喂食，整个急性试验期间不喂食。

1 3 方法

预试验：在27 cm×13 cm×15 cm的玻璃水族缸中每缸盛放4 L试液，分别设置8个预试验浓度组，链霉素出水体积百分比分别为：20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。用曝气48 h的除氯自来水进行稀释，水质指标满足GB 11607—1989 《渔业水质标准》。每组随机放入10尾鱼，连续试验 96 h，每天更换试验溶液。试验结果显示，连续试验96 h后，并未观察到任何1个试验组的斑马鱼全部死亡。急性毒性试验：根据上述预试验结果进行急性试验浓度设置，链霉素废水出水选择20%、40%、60%、80%、100%体积百分比来观察链霉素废水出水对斑马鱼造成的影响，每组10尾鱼。亚急性毒性试验：对于链霉素废水出水，设定亚急性毒性试验浓度为：10%、20%、30%、40%，研究不同暴露浓度链霉素废水出水对斑马鱼的氧化损伤。试验设置1个空白组、4个试验组，每个试验组设置3个平行组。在5 L鱼缸中分别放入4 L试验液，充分混合曝气后将驯养的斑马鱼随机放入各个试验组中，每组投放20尾鱼，并进行连续曝气。亚急性毒性试验历时 15 d，每天至少测定1次试验液中的溶解氧含量、pH值、硬度、水温。采用静态置换法，每天换水，分别于3、6、9、12、15 d测定斑马鱼肌肉组织SOD活性、MDA含量。

1 4 样品处理

每次从相应的试验组中取5尾试验鱼，解剖，取其肌肉组织，在冰冷的0 86%生理盐水中漂洗，滤纸拭干，准确称取组织质量，放入玻璃匀浆管中；用移液器按1 ∶ 9（质量体积比）取预冷的0 86%生理盐水，加入匀浆管中进行匀浆，在冰水浴中进行匀浆，充分研磨约8 min，制得10%组织匀浆。将制备好的匀浆液用普通离心机在3 000 r/min下离心10 min，取其上清液保存于4 ℃冰箱中。采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量；采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性；采用硫代巴比妥酸反应（TBA）比色法测定MDA含量。endprint

1 5 试验条件

试验所用废水来自链霉素生产过程中的提炼工段，化学需氧量（COD）、生化需氧量（BOD5）、悬浮物、氨氮浓度分别为200、50、50、4 12 mg/L，色度为21。试验用水pH值约75，总硬度约100 mg/L，试验温度为22～24 ℃，溶解氧含量不低于5 mg/L。试验期间用曝气装置连续曝气，为了保证其浓度，每24 h换1次试验液，每天至少测定1次试验溶液的水温、硬度、pH值、溶解氧含量。

1 6 数据处理

试验结果用“平均值±标准差”来表示。

2 结果与分析

2 1 急性毒性试验结果

96 h内，80%、100%浓度组斑马鱼出现侧翻现象，游动十分迟缓。80%浓度组斑马鱼死亡4尾，100%浓度组斑马鱼死亡5尾。40%、60%浓度组斑马鱼游动缓慢，未出现侧翻。20%浓度组斑马鱼行为未出现明显异常。黄健等选用链霉素对6种海洋微藻进行试验，结果表明，只有角毛藻、三角褐指藻在试验浓度范围内（0～500 mg/L）测到了72 h半抑制浓度，EC50分别为346、445 mg/L，其他4种海洋微藻均未测到72 h半抑制浓度 [10]。

2 2 亚急性毒性试验

2 2 1 生化法处理后的链霉素生产废水出水对斑马鱼肌肉SOD活性的影响由图1可知，3 d时，10%试验组斑马鱼体内SOD活性比对照增加，但无显著差异；20%、30%、40%试验组斑马鱼体内SOD活性出现显著性诱导作用，说明生化法处理后的链霉素废水出水能够引起斑马鱼氧化应激反应。斑马鱼通过升高SOD活性来抵御 O-2[KG- 2]· 对机体的侵害作用。6 d时，10%试验组斑马鱼体内SOD活性比对照增加；20%、30%试验组则表现出抑制作用，但无显著性差异；40%试验组表现出显著抑制作用。这可能是因为随着暴露时间的延长，链霉素废水中污染物在鱼体内不断地累积，导致鱼体内产生大量O-2·，过多的O-2·消耗了SOD，也可能是过量的O-2·对鱼体抗氧化酶产生了直接损伤，导致SOD活性降低。9 d时，10%试验组表现为对SOD活性有诱导作用但无显著差异，其值略高于空白对照组；20%、30%、40%试验组均表现为抑制作用但无显著性差异，其值略低于空白对照组。12 d时，10%、30%试验组表现出抑制作用但无显著差异；20%试验组表现出诱导作用但无显著性差异；40%试验组表现出显著诱导作用。15 d时，10%、40%试验组显现出诱导作用但无显著差异；20%、30%试验组表现出抑制作用但无显著差异。综上所述，生化法处理后的链霉素废水出水比例为10%时对鱼体影响是可逆的，并未超过其抗氧化防御系统阈值，斑马鱼的抗氧化防御系统最终达到了新的平衡。

2 2 2 生化法处理后的链霉素生产废水出水对斑马鱼肌肉MDA含量的影响如图2所示，3 d时，10%、20%、30%、40%试验组斑马鱼肌肉MDA含量均表现为诱导作用，但是无显著差异。6 d时，20%、30%试验组斑马鱼肌肉MDA含量均表现为显著诱导作用。9 d时，30%试验组出现抑制作用但无显著差异；10%、20%、40%试验组表现为诱导作用但无显著差异。试验后期（9～15 d），所有试验组MDA含量均与空白对照组无显著差异。综上所述，3 d时所有试验组斑马鱼肌肉MDA含量均表现出诱导作用，说明生化法处理后的链霉素废水出水比例为10%时就已经引起了鱼体脂质过氧化损伤；6 d时20%、30%试验组显现出显著诱导效果；9～15 d 时，10%、20%、40%试验组与空白对照组无显著差异。本试验浓度范围已经引起了斑马鱼脂质过氧化损伤，9～15 d时与空白对照组无显著差异，说明斑马鱼抗氧化防御系统达到了新的平衡，该试验结果与SOD活性测定结果一致。

3 结论与讨论

3 1 生化法处理后的链霉素废水出水对SOD活性影响

SOD是生物体内抗氧化防御系统中重要的抗氧化酶，主

要分布在胞浆和线粒体的基质内 [11-13]，由于其是唯一1种以自由基为底物的抗氧化酶，因此在活性氧自由基清除方面中发挥着重要作用。本研究结果表明，暴露初期（3 d），暴露组SOD活性较空白组升高，说明斑马鱼在受到外界刺激时，生物体内阴离子氧自由基数量增多，SOD被激活，保护系统被打开，阴离子氧自由基刺激了SOD合成来清除阴离子氧自由基，减少细胞膜的过氧化作用。随着暴露时间的延长（6～9 d）， SOD活性因消耗而降低，或者SOD合成受到抑制。该研究结果与前人的研究结果 [6，14]一致，即生物体暴露于污染环境后其SOD活性均出现先诱导后抑制现象。这可能是因为链霉素废水中污染物在鱼体内累积，导致阴离子氧自由基在鱼体内累积速度加快，从而使SOD合成速度跟不上斑马鱼体内阴离子氧自由基增加速度，抑制了SOD合成，也可能是SOD因消耗而活性降低，导致阴离子氧自由基的产生和消除平衡被破坏，机体细胞膜系统被氧化。暴露后期（12～15 d），SOD活性回到空白对照水平，可能是由于此时机体已对暴露物的逆境胁迫表现出了一定的耐受性，而且该污染胁迫没有超出鱼体耐受力，SOD再次被刺激，产生应激反应，活性再度升高，说明鱼体内抗氧化防御系统正在发挥作用，并且形成新的平衡。

3 2 生化法处理后的链霉素废水出水对MDA含量影响

MDA作为氧化损伤最终形成的脂质过氧化产物，其含量可间接反映机体自由基水平，是毒性作用、保护作用的综合反映 [15]。研究发现，当污染物进入生物体内进行生物转化时，可形成大量活性氧自由基，这些活性氧自由基若不及时清除，就会引起DNA断裂、脂质过氧化、酶失活等损伤，对机体造成氧化胁迫 [16]。暴露初期（3 d），所有暴露组MDA含量较空白升高，这与SOD活性变化规律一致，说明斑马鱼在受到外界刺激时，MDA含量与SOD活性同时被激活，鱼体通过产生MDA来清除阴离子氧自由基对生物体的迫害，说明此时斑马鱼已经受到脂质过氧化损伤。随着暴露时间的延长，MDA含量存在一定程度的显著诱导。暴露后期（9～15 d），MDA含量维持在对照水平，说明鱼体消除了过多的阴离子氧自由基，达到了新的平衡，表明该污染胁迫仍在鱼的承受范围内，这与沈洪艳等关于抗生素药物环丙沙星对锦鲤抗氧化系统的毒性作用结果 [17]一致。随着暴露时间延长与暴露浓度升高，SOD活性逐渐下降，与此同时，MDA含量呈现上升趋势 [18]。本试验中，30%试验组出现MDA含量低于对照组的情况，也有不少学者发现了同样的现象 [19-22]。本试验结果原因可能是随着自由基的积累，虽然SOD活性下降，但是机体内还存在其他酶被激活，清除过多阴离子氧自由基的作用，从而使鱼体内的抗氧化防御系统保持在稳定状态。endprint

斑马鱼暴露在生化法处理后的链霉素废水出水中15 d，40%体积百分比试验组斑马鱼鱼体SOD活性呈现出诱导—抑制—诱导—回落的趋势，说明该试验组链霉素废水出水能够引起斑马鱼的氧化应激反应，并且15 d时机体已对链霉素废水出水的逆境胁迫表现出了一定的耐受性。MDA含量均呈现诱导—回落的趋势，说明经过生化法处理后的10%、20%、30%、40%体积百分比链霉素废水出水均能够引起斑马鱼的脂质氧化性损伤，但是其污染胁迫水平在斑马鱼可以承受的范围之内。斑马鱼肌肉组织SOD活性、MDA含量在暴露过程中以诱导为主，表明经过生化法处理后的链霉素生产废水出水比例达到10%时就可以对斑马鱼产生氧化损伤效应，但是比例达到40%时其对斑马鱼的氧化损伤程度并未超过其抗氧化防御系统的阈值，斑马鱼的抗氧化防御系统最终达到了新的平衡，说明鱼体抗氧化防御系统具有自我调节功能。斑马鱼SOD活性、MDA含量均对链霉素生产废水出水的胁迫有应激反应，两者有协同性，但是SOD活性比MDA含量更敏感。

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