杨 飞 ,方智三 ,刘 俊 ,粟有志

(1.新疆维吾尔自治区分析测试研究院,乌鲁木齐 830011; 2.乌鲁木齐海关技术中心,乌鲁木齐 830063;3.伊宁海关技术中心,伊宁 835000)

乙氧呋草黄又名甜菜呋、甜菜净、乙呋草黄,化学名称2-乙氧基-2,3-二氢-3,3-二甲基-5-苯并呋喃甲基磺酸酯,其通过减少植物的光合作用和呼吸作用来抑制细胞分裂,从而控制阔叶杂草和禾本科杂草的生长,是一种低毒、广谱选择性除草剂[1-4]。GB 2763－2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》规定了乙氧呋草黄在甜菜根中的最大残留限量为0.1 mg·kg－1;美国环保署修订了乙氧呋草黄在甜菜根和甜菜糖浆中的最大残留限量分别为1.5,2.0 mg·kg－1;日本肯定列表规定乙氧呋草黄在甘蓝、胡萝卜、番茄等植物源性食品中的最大残留限量为0.1～1.0 mg·kg－1。然而当前国内外尚无食品中乙氧呋草黄残留量的测定方法标准。文献报道的乙氧呋草黄测定方法主要有液相色谱法[5-7]、气相色谱-质谱法[8-9]、液相色谱-串联质谱法[10-15]。液相色谱法为半定性分析方法,不能对目标物进行确证;气相色谱-质谱法虽然可对目标物进行确证,但存在抗基质干扰能力弱、检出限较高等缺点;液相色谱-串联质谱法以多残留分析为主,缺少对乙氧呋草黄进行较为全面系统的研究,同时亦未对糖蜜、胡萝卜等样品进行方法学考察。本工作改进了传统的QuECh ERS 前处理,以石墨化多壁碳纳米管(MWNTs)、强阴离子交换机理的硅胶和N-丙基乙二胺等3种材料为净化剂,结合高效液相色谱-串联质谱法建立了植物源性食品中乙氧呋草黄残留量测定的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1260型高效液相色谱-6460A 型串联质谱仪,配电喷雾离子源和Optimizer软件;GM 200型刀式混合研磨仪;EYELA MMV-1000W 型振荡器;Sigma 3-18K 型台式冷冻离心机;N-EVAP-112型水浴氮吹仪;IKA MS3型涡旋振荡器;Milli-Q Advangtage A10型超纯水系统。

乙氧呋草黄标准储备溶液:1 000 mg·L－1,称取乙氧呋草黄标准品10.0 mg,用少许甲醇溶解后,用甲醇定容于10 mL容量瓶中,于4 ℃避光保存。

石墨化多壁碳纳米管(XFM40,直径10～20 nm,长度5～30μm)、石墨化羧基多壁碳纳米管(XFM42,直径10～20 nm,长度5～30μm)、多壁碳纳米管(XFM13,直径10～20 nm,长度10～30μm)、石墨化多壁碳纳米管(XFM25,直径30～50 nm,长度小于10μm)、石墨化多壁碳纳米管(XFM04,直径5～15 nm,长度0.5～2μm);石墨化碳黑(GCB)、C18粉、氨基键合硅胶(NH2)、N-丙基乙二胺(PSA,粒径40～60 μm)、酸性氧化铝(ALA)、硅酸镁吸附剂(Florisil,粒径150～200μm);强阴离子交换机理的硅胶(SAX,粒径50μm)、强阳离子交换机理的硅胶(SCX,粒径50μm)、官能化聚苯乙烯/二乙烯苯极性增强聚合物(PEP,粒径80～10μm)、强阳离子交换混合机理的水可浸润型聚合物(PCX,粒径40～60μm)、弱阳离子交换混合机理的水可浸润型聚合物(PWCX,粒径40～60μm)、强阴离子交换混合机理的水可浸润型聚合物(PAX,粒径40～60μm)、官能化聚苯乙烯/二乙烯苯中等极性聚合物(HXN,粒径40～60μm)。

乙氧呋草黄标准品的纯度为99%;其余试剂均为色谱纯;试验用水为超纯水系统制备的一级水。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 JADE-PAK CB-C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,3 μm),柱温30 ℃;进样量10.0μL;流量0.25 mL·min－1。流动相:A 为0.1%(体积分数,下同)甲酸溶液,B 为乙腈。梯度洗脱程序:0～0.5 min 时,B 为5%;0.5～1.0 min时,B由5%升至75%;1.0～6.5 min时,B 由75%升至95%,保持1.0 min;7.5～7.6 min时,B由95%降至5%。

2)质谱条件 电喷雾离子源(ESI),正离子模式;多反应监测(MRM)模式;毛细管电压4 k V;干燥气温度350 ℃,干燥气流量11.0 L·min－1;鞘气温度250 ℃,鞘气流量10.0 L·min－1;碎裂电压140 V;驻留时间50 ms。定性离子对质荷比(m/z)为286.9/121.1,286.9/259.1,286.9/161.1,碰撞能量分别为4,16,12 e V,其中m/z286.9/121.1为定量离子对。

1.3 试验方法

样品为流通市场随机抽检样品和试验室日常送检样品。

西红柿、黄瓜、梨等含水量较高的样品:称取5.00 g于50 mL 具塞离心管中,加入10 mL 正己烷。大豆、玉米、大米等含水量较少的样品:称取5.00 g于50 mL 具塞离心管中,加入15 mL 水,浸泡30 min后,加入20 mL 正己烷。将上述离心管水平振荡10 min,以8 000 r·min－1转速离心3 min,取上层(正己烷层)的1/2 体积(5 mL 或者10 mL)于20 mL玻璃试管中,于40 ℃水浴中氮吹至干,加入5 mL 的50%(体积分数,下同)乙腈溶液,再加入1 g 氯化钠,涡旋10 s溶解残渣,静置5 min。取上清液1.5 mL 于预先装有吸附剂(XFM40、SAX、PSA 各50 mg)的2 mL带盖离心管中,盖好离心管盖子,涡旋30 s,以10 000 r·min－1转速离心5 min,移取上清液,过0.22μm 尼龙滤膜至进样小瓶,按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

分别以0.1% 甲酸溶液、含0.1% 甲酸的10 mmol·L－1乙酸铵溶液、10 mmol·L－1乙酸铵溶液、水为流动相的A 相(无机相),乙腈、甲醇为流动相的B 相(有机相),通过不同A 相与B 相的组合,优化乙氧呋草黄的流动相。结果表明:0.1%甲酸溶液和乙腈组合时,乙氧呋草黄的离子对信号最好,离子化效益最高。试验选择流动相为0.1%甲酸溶液和乙腈。

试验通过进一步设定梯度洗脱,有效降低了基质对乙氧呋草黄的干扰,获得较好的分离度和响应信号。试验选择的色谱条件见1.2节。

2.2 质谱条件的选择

分别用电喷雾离子源正离子扫描(ESI＋)和电喷雾离子源负离子扫描(ESI－)对同一质量浓度的乙氧呋草黄标准溶液进行母离子扫描。结果发现:[M＋H]＋(m/z286.9)的响应信号明显优于[M＋H]－(m/z285.0)的响应信号。这说明乙氧呋草黄适用ESI＋,试验选用ESI＋。

采用Optimizer软件分别对子离子、碎裂电压、碰撞能量等质谱参数进行优化,最终选择了测定信号较强、本底干扰较小的m/z286.9/121.1、m/z286.9/259.1和m/z286.9/161.1这3对离子对作为定性离子对,其中测定信号最强的m/z286.9/121.1为定量离子对。试验选择的质谱条件见1.2节。

乙氧呋草黄的可能裂解途径见图1。

图1 乙氧呋草黄的可能裂解途径Fig.1 Possible fragmentation pathway of ethofumesate

2.3 前处理条件的选择

试验选用色素含量较高、基质成分复杂的黄瓜作为方法优化样品,添加乙氧呋草黄标准溶液至黄瓜样品中(乙氧呋草黄的质量分数为50.0μg·kg－1)。试验考察了提取剂依次为正己烷、乙腈、1%(体积分数,下同)甲酸乙腈溶液、丙酮、乙酸乙酯时对乙氧呋草黄提取效率的影响。结果表明:提取剂为丙酮时,乙氧呋草黄的回收率仅为72.5%,其余4种提取剂的回收率为90.0%～100%。

根据相对响应值公式[公式(1)]计算乙氧呋草黄的基质效应:

式中:χME为基质效应;Am 为空白基质中标准响应值;Ac为纯溶剂标准响应值。

基质效应大于100%时,为基质增强效应;基质效应小于100%时,为基质抑制效应。

试验进一步考察了提取剂依次为正己烷、乙腈、1%甲酸乙腈溶液、乙酸乙酯时,乙氧呋草黄在黄瓜样品中的基质效应,结果分别为49.8%,56.6%,54.3%,48.5%。试验还发现:提取剂为乙腈和1%甲酸乙腈溶液时,提取液颜色较深,含有部分的色素;提取剂为正己烷和乙酸乙酯时,提取液的颜色较为清澈。综合考虑样品基质效应和色素净化效果,试验选择提取剂为正己烷和乙腈。

试验考察了正己烷提取、乙腈提取和以正己烷进行第一次提取后,再用50%乙腈溶液进行二次提取(简称二次提取)等3种提取方法对乙氧呋草黄在黄瓜、梨、甘蓝、葡萄、土豆、大米、大豆、玉米、糖蜜、甜菜、胡萝卜、番茄等12种基质样品中基质效应的影响,结果见图2。

图2 提取方法对乙氧呋草黄基质效应的影响Fig.2 Effect of extraction method on matrix effect of ethofumesate

由图2可知:经过二次提取之后,乙氧呋草黄的基质效应得到了明显的改善。试验中样品以正己烷进行第一次提取后,再用50%乙腈溶液进行二次提取。

按试验方法采用XFM40、XFM42、XFM13、XFM25、XFM04、GCB、C18、NH2、PSA、ALA、Florisil、SAX、SCX、PEP、PCX、PWCX、PAX、HXN 等18种吸附剂(用量均为50 mg),分别对黄瓜样品进行净化,吸附剂对乙氧呋草黄回收率的影响见图3。

由图3 可知:吸附剂为SCX、PCX、PWCX、HXN、XFM42、XFM13时,乙氧呋草黄的回收率小于80.0%;吸附剂为其余12 种吸附剂(XFM40、XFM25、XFM04、GCB、C18、NH2、PSA、ALA、Florisil、SAX、PEP、PAX)时,乙氧呋草黄的回收率为80.0%～115%,均可满足方法学的要求。

图3 吸附剂对乙氧呋草黄回收率的影响Fig.3 Effect of adsorbent on recovery of ethofumesate

试验进一步考察了其余12种吸附剂(XFM40、XFM25、XFM04、GCB、C18、NH2、PSA、ALA、Florisil、SAX、PEP、PAX)对乙氧呋草黄基质效应的影响,结果见图4。

图4 吸附剂对乙氧呋草黄基质效应的影响Fig.4 Effect of adsorbent on matrix effect of ethofumesate

由图4 可知:吸附剂为GCB、XFM40、SAX、PSA、NH2时,乙氧呋草黄的基质效应优于其他吸附剂存在时乙氧呋草黄的基质效应。GCB 和XFM40均具有较强的吸附色素能力,两者用量均为50 mg时,XFM40吸附后,提取液更为清澈,因此试验选择XFM40作为色素去除剂。PSA 和NH2均具有铵根基团,对酸性化合物具有吸附作用,二者的吸附机理类似,但PSA 净化时,乙氧呋草黄的基质效应略优于NH2净化时乙氧呋草黄的基质效应,因此试验选择PSA 进行下一步试验。试验最终选择XFM40、SAX、PSA 这3种吸附剂共同净化样品。

2.4 基质效应

按试验方法以黄瓜、梨、甘蓝、葡萄、土豆、大米、大豆、玉米、糖蜜、甜菜、胡萝卜、番茄等12种样品为基质,乙氧呋草黄的基质效应见表1。

表1 乙氧呋草黄的基质效应Tab.1 Matrix effect of ethofumesate

由表1可知:不同的样品基质均对乙氧呋草黄有一定的基质效应。试验采用基质匹配标准曲线可有效弥补基质效应对测定结果的干扰。

2.5 标准曲线、检出限和测定下限

称取黄瓜、梨、甘蓝、葡萄、土豆、大米、大豆、玉米、糖蜜、甜菜、胡萝卜、番茄等空白样品各5.00 g,按试验方法进行前处理,获得空白基质滤液,逐步用空白基质滤液稀释1 000 mg·L－1乙氧呋草黄标准储备溶液,获得20,40,100,200,500,100μg·L－1的基质匹配标准溶液系列。

按仪器工作条件对上述标准溶液系列进行测定,以乙氧呋草黄的质量浓度为横坐标,与其对应的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。结果表明:乙氧呋草黄在不同基质中的线性范围均为20～100μg·L－1,线性回归方程和相关系数见表2。

以3倍信噪比和10倍信噪比计算方法的检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),结果见表2。

2.6 方法的准确度和精密度

按试验方法对黄瓜、梨、甘蓝、葡萄、土豆、大米、大豆、玉米、糖蜜、甜菜、胡萝卜、番茄等空白样品进行加标回收试验,每个添加水平平行测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表3。

由表3可知:回收率为74.1%～121%,RSD 为2.8%～16%。

空白黄瓜样品的色谱图见图5,空白黄瓜加标样品的色谱图见图6。

表2 线性回归方程、相关系数、检出限和测定下限Tab.2 Linear regression equations,correlation coefficients,detection limits and lower limits of determination

表3 准确度和精密度试验结果(n＝6)Tab.3 Results of tests for accuracy and precision(n＝6)

图5 空白黄瓜样品的色谱图Fig.5 Chromatograms of the blank sample of cucumber

2.7 样品分析

按试验方法对市场上流通销售的12种植物源性食品(黄瓜、梨、甘蓝、葡萄、土豆、大米、大豆、玉米、糖蜜、甜菜、胡萝卜、番茄)共计100余份样品进行分析。结果发现:在1 份甜菜样品中检出25.2μg·kg－1乙氧呋草黄,其余样品中均未检出乙氧呋草黄。

图6 空白黄瓜加标样品的色谱图Fig.6 Chromatograms of the blank sample of cucumber added with standard

本工作采用石墨化多壁碳纳米管复合净化-高效液相色谱-串联质谱法测定植物源性食品中乙氧呋草黄的残留量,方法简便快捷、灵敏度高、实用性强,试验结果符合残留测定的相关要求,可为植物源性食品中乙氧呋草黄残留量的检验监管提供技术支撑。