王 霞， 欧阳艳艳， 王 晶， 王尚君， 董莲华

(1.中国计量科学研究院，北京 100029；2.南京市计量监督检测院，江苏 南京 210049)

1 引 言

基因测序技术和产业始于1990年启动的人类基因组计划[1]，是被全球生物科技界公认的对人类健康事业影响深远的基础性技术和效益外溢性极强的产业。基因序列测量的准确性直接关系到人们对于生命活动的判断，例如癌症诊断[2～4]、无创产前诊断[5]等。高通量测序技术(high-throughput sequencing)又称下一代测序技术(next generation sequencing technology, NGS technology)，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志[6]，使得对一个物种的基因组深度测序变得方便易行。

目前市场主流NGS测序仪包括Illumina和Life Technologies公司的测序平台[7,8]，这2大测序平台文库的定量分析和质量评价对于获得高质量的核酸测序数据十分关键。如果过高的估计测序文库拷贝数，将不能获得足够的测序数据，导致降低数据产出；如果过低的估计测序文库拷贝数，将产生低质量的测序数据，甚至会导致测序失败。因此，要控制NGS测序文库的载入量，保证测序数据的质量，就需要在测序前对DNA测序文库进行定量质量控制。此外，为减少NGS运行成本，往往需要将不同测序文库等摩尔量合并为一份测序样品同时测序，这也以测序文库的准确定量分析为前提，这样才能保证不同文库的测序数据的可靠性。

因此本研究以主流的Illumina高通量平台为对象，开展DNA文库定量质量控制技术研究，建立了DNA文库绝对定量数字PCR方法，可用于DNA文库定量标准物质的定值。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

大肠杆菌DH5为中国计量科学研究院保存；5个水平的文库定量标准物质由中国计量科学研究院研制；SYBR荧光染料试剂盒购置于江苏康为世纪生物科技有限公司；数字PCR芯片和GE loading试剂购自美国Fluidigm公司；EvaGreen mastermix购自美国伯乐公司。

2.2 方法

2.2.1 荧光定量PCR

采用Roche480荧光定量PCR仪，分别测定KAPA公司和Qiagen公司的定量标准品。PCR扩增体系20 μL：2×SYBR PCR mastermix 10 μL，双向引物(浓度为10 μmol/L)0.4 μL，DNA模板4 μL，ddH2O 5.6 μL。PCR反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s， 60 ℃ 40 s，45 cycles。熔解曲线：95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min， 95 ℃连续采集信号。

2.2.2 数字PCR方法

采用数字PCR方法测定文库定量标准物质的拷贝数浓度，再通过式(1)换算成摩尔浓度。按照下述步骤进行芯片数字PCR反应液的配制。

(1)

式中：cmol为摩尔浓度，pmol/L；ccopy为拷贝数浓度，copy/L；NA为阿伏加德罗常数。

芯片数字PCR(cdPCR)方法的实验操作步骤[9]：首先对12×765芯片标记A1的一端孔内加入1 mL的矿物油，然后将芯片放入加样器(IFC controller)，点击“prime”对芯片进行prime。待prime完成后，首先在12×765芯片样品孔的两端孔内加入10 μL的无DNA水；然后将配制好的含有DNA模板的PCR反应液10 μL(包括5 μL的SYBR master mix，0.2 μL的引物，0.5 μL的GE loading，0.1 μL的ROX，2 μL的DNA，2.2 μL的TE)加入到标记1～12的样品孔内，其中孔1～11加入DNA样本，第12个孔加入NTC(无DNA对照)。再将芯片转移至加样器，点击“load”进行样品的加入。待样品加样完成后将芯片转入BioMark数字PCR仪进行PCR扩增。扩增条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 40 s，45 cycles，PCR扩增结束后采用Fluidigm的Digital PCR analysis软件进行分析处理。

微滴数字PCR(ddPCR)实验操作步骤见之前的文献报道[10～12]，微滴生成在微滴发生卡上进行：将配制好的含有DNA模板的PCR反应液20 μL(包括10 μL的EvaGreen master mix、0.4 μL的引物、4 μL的DNA、5.6 μL的TE)加入到标记有“Sample”的样品孔内，加入60 μL的微滴生成油至标记有“Oil”孔内。然后将微滴发生卡转移至微滴生成仪。待生成微滴后，转移微滴至96孔板，然后进行PCR扩增。扩增好的96孔板在在微滴阅读器上阅读微滴。数据采用软件QuantaSoft 1.7.4版本进行分析。

3 实验结果与分析

3.1 荧光定量PCR方法

以大肠杆菌DNA文库为模板使用上述PCR引物和扩增条件扩增后的得到的熔解曲线为一单峰，如图1(a)所示，tm(DNA熔解温度)为80 ℃左右；而以其它非特异性DNA作为模板，使用同一PCR引物和扩增条件进行扩增后得到的熔解曲线不是单一峰，如图1(b)所示。

图1 DNA文库定量PCR扩增熔解曲线Fig.1 Melting curves of DNA library quantitative PCR amplification

因此，可以很清楚地根据熔解曲线来判断该PCR方法具有良好的扩增特异性。

3.2 芯片式数字PCR

将优化好的PCR方法及体系平行转移至cdPCR平台上进行绝对定量准确性及一致性研究。一张芯片12个孔，其中孔1～11加入DNA样本，第12个孔加入NTC(无DNA对照)。扩增结果见图2，首先从图2中的阴性对照(NTC，Panel12)看，没有热点(深色点)出现，表明扩增体系中没有DNA污染；其次看标准物质的扩增结果(Panel 9～11)，每个Panel中扩增得到的热点(深色点)数目介于400～700之间(见表1)，λ即每个反应室内的平均分子数为1.22～1.28，且分布随机。表明加入的起始DNA分子浓度适中，且得到了较好的扩增。

图2 芯片数字PCR(cdPCR)扩增结果图Fig.2 Amplification results of chip digital PCR (cdPCR)

3.3 微滴数字PCR

ddPCR扩增结果见图3。扩增生成的总微滴数和阳性微滴数见表2。样本扩增结果(F02)(通道1)得到了两簇(阳性微滴和阴性微滴)微滴，表明建立的ddPCR方法得到了较好的扩增；而阴性对照(E05)扩增结果仅为一簇微滴，从荧光值判断为阴性微滴，阳性微滴个数为0，表明扩增体系干净无污染。

表1 每个Panel的阳性反应室数目和每个反应室内的平均DNA分子数Tab.1 Number of positive reaction chambers per Panel and average number of DNA molecules per reaction chamber

图3 微滴数字PCR(ddPCR)扩增结果图Fig.3 Amplification results of droplet digital PCR (ddPCR)

3.4 不同数字PCR平台可比性

采用cdPCR和ddPCR对所研制的Level 2水平的文库定量标准物质定值，考察不同平台的一致性。对芯片每个单反应小室和每个微滴的体积进行修正后[13]，验证结果表明对同一标准物质测定时两种平台测量结果一致(见表3和图4)。

由于ddPCR方法中微滴数显著多于cdPCR中的反应小室个数，所以ddPCR方法的精密度好于cdPCR方法的精密度，这与测量不确定度的评定结果一致。从表4可以看出ddPCR由测量方法精密度引入的不确定度ua显著优于cdPCR。综合考虑所有不确定度来源，分别将其合成得到ddPCR和cdPCR的扩展不确定度，ddPCR优于cdPCR。2个数字PCR平台测量结果的不确定度分量见表4。

图4 不同数字PCR平台对同一标准物质量值的验证结果Fig.4 Verification results of different digital PCR platforms on the same standard substance value

表2 微滴数字PCR阳性微滴数和总微滴数Tab.2 number of positive dorplets and total accepted droplets in droplet digital PCR

3.5 标准物质适用性验证

制备了5个水平的文库定量标准物质，其目的是用于制作荧光定量PCR的标准曲线来定量测定测序DNA文库浓度，所以5个水平的标准物质经过荧光定量PCR扩增后的线性需要进行检验。将制备好的5个不同水平的DNA文库标准物质作为模板，采用建立的PCR扩增体系和扩增程序进行扩增，检测结果如图5(a)。以拷贝数对数为横坐标，以Ct值为纵坐标得到的标准曲线为：y=-3.74x+38.87，R2=0.995，标准曲线的线性相关系数大于0.99，如图5(b)，斜率对应的扩增效率为85%。可见5个水平的标准物质经过荧光定量PCR扩增后线性关系良好，可以作为DNA文库定量的标准曲线。

表3 cdPCR和ddPCR对Level 2标准物质测定结果比较Tab.3 Comparison in measurement result of reference material of Level 2 determined by cdPCR and ddPCR

表4 cdPCR和ddPCR方法的测量结果不确定度评定Tab.4 Uncertainty evaluation of measurement result determined by ddPCR and cdPCR

图5 5个水平文库定量标准物质荧光定量PCR扩增曲线和标准曲线Fig.5 Fluorescence quantitative PCR amplification curves and standard curves of 5 level libraries

4 结 语

本文以主流的Illumina高通量测序平台为对象，开展DNA文库定量质量控制技术研究，建立了基于SYBR Green荧光染料嵌合的高特异性数字PCR绝对定量方法，用于DNA文库定量标准物质的定值，并对制备的文库定量标准物质的适用性进行了验证。结果表明制备的5个水平的文库定量标准物质线性良好，可以作为Illumina平台DNA文库定量的标准曲线。