王 智， 李 琪， 黄 鹭， 高思田， 孙 淼， 董明利

(1. 中国计量科学研究院，北京 100029；2. 北京信息科技大学 仪器科学与光电工程学院，北京 100192)

1 引 言

近年来，纳米技术发展迅速，现已成为最为广泛研究的学科之一[1]。目前国内外测定纳米颗粒粒径常见的方法有透射电镜观察法、扫描电镜观察法、X射线衍射线宽法(谢乐公式)等[2,3]。研究表明: X-射线衍射线宽法测定纳米颗粒晶粒度应用较为普遍；电镜观察法可直观的测量纳米颗粒粒度的方法，同时还可观察纳米粒子的形貌甚至结构，因此是观测纳米颗粒粒度的最好方法[4]。扫描电镜(scanning electron microscopy，SEM)是一种大型的分析仪器，主要功能是对固态物质的形貌显微分析和对常规成分的微区分析，在纳米级别材料的形貌观察和尺寸检测方面因具有准确、可操作性强的优势被大量采用[5]。SEM利用聚焦非常细的高能电子束在试样上扫描，激发出各种物理信息，获得测试试样表面形貌的观察[6,7]。然而受到颗粒堆积与观察角度的影响，后期选取不同排除、判断的规则得到的结果有着很大偏差。对颗粒分散性好、团簇较少的情况进行判别、筛选及粒径计算，主要采取人工手动操作，但实际测量过程中团簇及残缺情况较多，且只能对单个颗粒进行选取，误差范围大。

本文提出了一种基于数学几何学的思想，在MATLAB程序开发环境上，采用准确的图像边缘轮廓提取算法，对颗粒轮廓进行判断和准确提取，并通过改变和尝试不同算法，提出更为精确的颗粒直径自动计算方法及结果，并通过实际数据验证粒径求解。

2 试验步骤

2.1 试验样品与制样

试验选取美国ThermoFisher公司的NanophereTM尺寸标准物。样品为聚苯乙烯微粒悬浊液，由美国国家标准与技术研究院(NIST)可溯源的纳米级计量法标定。纳米微粒尺度标准产品是由15 mL滴瓶包装的水性悬浮液，不含残留杂物。该系列产品的颗粒密度为1.05 g/cm3,标准偏差为8.4 nm，差异系数为16.5%，最大质量浓度为1%，粒径的电镜标称值分别为100 nm、200 nm、300 nm、500 nm，实际溯源大小为(100±6) nm、(203±5) nm、(303±6) nm、(503±6) nm。将硅片切割成大小相同，形状为矩形的块状，分别将每块硅片的背面做好标记以便于区分。采用去离子水稀释浓溶液减小水中灰尘杂质对测量结果的影响。以100 nm稀释1000倍为例，将硅片先用H2O2化学处理，再进行超声波清理杂质。由于聚苯乙烯颗粒导电性不良，所以需要对其进行导电处理，制备完成进行观测。

2.2 SEM图像观测

利用5 kV电子束对不同大小颗粒进行观测，根据分散性和大小适当原则，分别得到放大20 000倍、10 000倍、6 000倍及3 000倍的试样原始扫描图像，见图1。

图1 扫描电镜原始图Fig.1 SEM original image

从图1中可以看出，每张图像都存在团簇或者残缺的颗粒，遵循样本越多准确性就越高的原则，需要将不满足要求的颗粒排除，只保留单个完好颗粒。

3 粒径提取算法

目前扫描电镜测量粒径方法主要为人工手动标注，但手动标注存在以下缺陷：

(1) 肉眼无法清晰分辨团簇和残缺颗粒；

(2) 无法准确判断颗粒边界，只能大概测量标注直径，误差较大；

(3) 数目众多手动标注颗粒直径不现实。

因此本文提出一种新的颗粒粒径提取方法(简称长短轴法)，能够实现粒径标注的自动化与准确化，该方法基于长短轴数学原理[8]，即通过长短轴的比值对颗粒是否团簇或残缺进行判断，以此筛选单个完整颗粒并标注单颗颗粒粒径。同时还提出一种标准偏差法对颗粒进行判断，并对两种方法进行对比与分析。

纳米粒径由于观测位置和溶液配制存在偏差，从扫描电镜图中得到的颗粒有3种情况：第1种是所需要的完整颗粒；第2种是2个及2个以上堆叠的颗粒群；第3种是残缺、面积明显小于单个完整颗粒的颗粒。根据研究目的需要将影响结果的后2种颗粒排除，提取所有单点。

本文算法流程如下：首先建立文件夹路径，将同一样本扫描图像放入该文件夹内; 再使用MATLAB软件对图像进行灰度化，将灰度图像二值化，消除噪点，获取连通区域，并且获取区域的‘basic’属性，提取每个连通区域的长短轴或者面积[9]; 然后，根据判断条件进行运算，将单点提取出来，根据最小二乘圆法计算每个颗粒半径，并计算每幅图像的平均颗粒半径；最后得到所有样本图像的平均半径。算法程序流程图如2所示。

图2 程序流程图Fig.2 Program Flow Chart

当图像中存在不完整或者团簇的颗粒时，需要将其去除，否则会对颗粒粒径测量造成影响。

3.1 长短轴法

当颗粒发生团簇时，颗粒之间会有部分区域重合，此时把重叠的颗粒可以近似为一个整体，该整体呈椭圆状具有长短轴，短轴与长轴的比值小于1，而单点颗粒呈圆状，圆是椭圆的特殊形式，它的长短轴相等，因此可以通过计算长短轴之比来排除团簇颗粒。当长短轴比值在一定范围内时，(即比值趋近于或等于1)，把该连通区域定义为圆。当2个颗粒堆叠在一起时，整体区域长轴大于短轴且圆心距大于0小于等于2R，故以此来判断颗粒是否需要去除。当颗粒数目大于2时，整个区域短轴与长轴的比值小于1。图3为长短轴法原理示意图。

图3 长短轴法原理示意图Fig.3 Schematic diagram of long and short axis method

对于确定颗粒，其粒径是一定值，以颗粒数目为2为例，设R为1，故短轴与长轴之比方程为：

f1(x)=2/(2+x)

(1)

式中：x为圆心距。当圆心距为0时，两圆完全重合，短轴与长轴值都为R，即f1(x)值为1；随着圆心距x增大，两圆逐渐分离，存在相交部分，此时短轴不变，长轴不断增大，这时f1(x)小于1；当圆心距x增大至2时，此时两圆相切，两颗粒处于临界状态。

图形面积也随着圆心距x而不断变化，定义面积比方程为：

(2)

当圆心距x为0时，f2(x)值为0.5，并且随着圆心距x增大而不断增大，临界状态下f2(x)值为1。

图4是半径为100 nm颗粒扫描电镜原图和使用长短轴法处理后的结果图，其中电镜原图对团簇颗粒进行了标注。可以看出，长短轴法可以将团簇颗粒去除干净。

图4 利用长短轴法处理结果Fig.4 Process results by long and short axis method

3.2 标准偏差法

使用长短轴法进行颗粒团簇判断的同时，面积也可作为判断条件。

在面积正态分布的假设下，可得总体标准差Se表达式[10]为

(3)

图5 利用标准偏差法法处理前后图像比较Fig.5 Image comparison before and after processing by standard deviation method

3.3 2种方法的对比

为检验2种单点筛选方法的可靠度[11,12]，现对其处理结果进行对比分析，见图6。从图6可以看出，当颗粒团簇残缺情况较少时，长短轴和标准偏差2种方法都能准确有效提取单点颗粒；但当团簇颗粒总面积与单个颗粒总面积相近时，标准偏差法存在无法去除粘连颗粒的问题，导致计算结果误差偏大。标准偏差法还存在其它缺陷，一是直接用面积来筛选颗粒没有用到更多要素，比如形状等，当单个面积与团簇面积接近时，该方法无法识别；二是前提为假设面积服从正态分布，但是实际情况很难满足这个假设。通过大量试验数据对比，长短轴法在处理团簇残缺情况中效果更加明显。

图6 不同情况下两种方法处理结果对比Fig.6 Comparisons of two methods in different cases

3.4 颗粒粒径计算

在筛选得到单个颗粒图像后，想要得到颗粒粒径必须要先对颗粒边缘检测，再对颗粒轮廓进行提取，提取出的轮廓进行计算粒径。本文采用Robert算子进行边缘检测，再利用bwperim函数提取颗粒轮廓，最后选取圆轮廓线上n个点，利用最小二乘拟合圆求出颗粒粒径。根据最常用的3种算子(Robert算子、Sobel算、Canny算子)的模板，利用MATLAB编写程序对单颗粒进行边缘检测，效果图见图7。

图7 3种算子对比图Fig.7 Contrast graphs of three operators

通过比较3种算法的效果图，可以发现选取3种算子进行边缘检测都会把颗粒中间的暗部分识别认为是边界，Robert识别颗粒内部能力较弱但效果好于另外2种算子。Canny算子对弱边缘较敏感导致噪音检测出来了，对后续处理影响较大。

最小二乘法是通过最小化误差平方和找到数据的最佳拟合函数通常用于曲线拟合[13,14]。测得圆轮廓线上n(n>3)个点[15,16]，将各点坐标记为xi、yi(i=1,…,n),然后求出各点到最小二乘圆的距离，按最小二乘法构造目标函数,函数求解结果x0、y0、R0即为最小二乘圆圆心坐标值和半径。图8为 300 nm 颗粒最小二乘拟合圆效果图。

图8 利用最小二乘拟合圆效果图Fig.8 Fits the circle effect map with least squares

表1为利用长短轴法测定粒径为200 nm颗粒的5次计算结果，其标准偏差为3.81 nm。

由于图像边缘是从暗逐渐变为亮，即灰度值从255变为0，并不是突变的，故灰度选取的阈值不同颗粒粒径也不同，所以在灰度范围内，选取最高灰度与最低灰度之间的10个值，进行计算比较灰度阈值选取对粒径的偏差。以200 nm颗粒为例，计算数据结果见表2，总平均粒径为205.47 nm，其标准偏差为6.03 nm。

采用长短轴法识别颗粒计算结果见表3。

表1 200 nm平均颗粒粒径和总平均粒径Tab.1 200 nm average particle size and total average particle size nm

粒径的电镜标称值为100 nm时，实际溯源大小为(100±6)nm，实际计算值为106.60 nm；粒径的电镜标称值为200 nm时，实际溯源大小为(203±5)nm，实际计算值为203.96 nm；粒径的电镜标称值为 300 nm 时，实际溯源大小为(303±6)nm，实际计算值为305.57 nm；粒径的电镜标称值为500 nm时，实际溯源大小为(503±6)nm，实际计算值为500.80 nm。从数据中可以发现计算结果在所提供真实值的范围内,这说明长短轴法测定颗粒粒径有效。

表2 计算数据结果Tab.2 Computational data results

表3 不同颗粒平均灰度及真实粒径Tab.3 Average gray level and real particle size of different particles

5 结 论

本文提出扫描电镜纳米颗粒粒径自动检测算法，采用长短轴提取单颗粒的方法，实现了对纳米颗粒自动挑选和粒径自动计算，此方法可用于对SEM扫描图像的修正。试验选取聚苯乙烯纳米颗粒验证结果表明:

(1) 对于团簇残缺较少的图像，采用长短轴比值和面积两种参数进行筛选，都能准确有效提取单点颗粒，但团簇残缺颗粒较多时采用长短轴比值效果更加准确，且计算颗粒粒径与实际值吻合良好。

(2) 标准偏差法直接用面积筛选时未考虑长短轴，忽略了颗粒的形状，导致可能发生两个颗粒粘连在一起的面积与单个面积相近时无法剔除；其次，标准偏差法的前提是假设面积服从正态分布，但是实际情况很难满足该假设。

(3) 在一定范围内，灰度选取的阈值不同颗粒粒径也不同，灰度阈值越大颗粒粒径也就越大，反之，阈值越小粒径越小，灰度阈值选择对粒径结果有很大的影响。

综上所述，长短轴法在提取单颗粒粒径方面具有明显优势，其计算颗粒粒径与实际数据吻合良好。