张 靖

上海交通大学附属第六人民医院消化科，上海 200233

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，尽管全球胃癌的发生率和死亡率呈下降趋势[1]，但在我国胃癌仍位居恶性肿瘤死因的第3 位[2]。传统中医药在抗肿瘤转移和复发、改善患者生活质量等方面也具有一定的作用。川楝素（toosendanin，TSN）是川楝树根皮及川楝子的有效提取物，具有多种生物学效应，包括抗肿瘤作用，抑制多种肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡[3-5]。我们前期研究[3-4]发现，TSN 可以通过阻断蛋白激酶B（protein kinase B，PKB 或AKT）/ 糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）信号通路抑制胃肠肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡，增强肿瘤细胞化学治疗（化疗）敏感性。

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一种共价闭合环状结构的非编码RNA，广泛存在于各种生物细胞中，它是由前体线性RNA 反向剪接产生，具有结构稳定、序列保守和组织特异性等特征[6]。circRNA 与胃癌密切相关：circ_0047905、circ_0138960 和circ_7690-15 在胃癌组织中高表达，促进胃癌细胞的增殖和侵袭能力[7]；circ_100269通过靶向miR-630 抑制胃癌增殖[8]；circDONSON 通过核小体重构因子（nucleosome remodeling factor，NURF）复合物依赖的SOX4（SRY-related HMG box transcription factor 4）激活促进胃癌生长和侵袭[9]；circLARP4 通过吸附miR-424-5p 激活大肿瘤抑制激酶1（large tumor suppressor kinase 1，LATS1） 抑 制 胃 癌 侵 袭 作 用[10]；circDLST 通 过 吸 附miR-502-5p 和 激 活NRAS（NRAS proto-oncogene，GTPase）/MEK1（mitogen-activated protein kinase kinase 1）/ERK1/2（mitogen-activated protein kinase 1/2）信号促进胃癌生长和侵袭[11]。我们利用TSN处理组和对照组筛选差异表达的circRNA，发现TSN 明显调控circDLST。本研究旨在通过观察TSN 对circDLST表达及胃癌生长的影响，为胃癌治疗提供潜在的策略。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂和仪器 TSN（纯度≥99%）购自上海源业生物科技有限公司，噻唑蓝（MTT）购自江苏凯基生物技术股份有限公司（南京），TRIzol 试剂购自美国Invitrogen 公司，circDLST 过表达及其空载对照慢病毒载体购自上海吉凯生物科技有限公司，反转录试剂盒和SYBR Green Master Mixture 购 自 日 本TaKaRa 公 司，Transwell 试剂盒购自美国BD 公司。实时荧光定量PCR仪购自美国Kray Technologies 公司，酶标分析仪（型号BS-1101）购自美国Bio-Rad 公司。

1.1.2 胃癌细胞系 人胃癌细胞系BGC-823 购自上海中国科学院细胞库。

1.1.3 实 验 动 物 雄 性BALB/c 裸 鼠（4 ～5 周 龄，18 ～20 g）购自中国科学院上海生命科学研究院上海斯莱克实验动物责任有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2017-0005。裸鼠饲养于上海市第六人民医院动物实验室，SPF 级饲养，带有密封空气过滤装置的塑料笼，实验动物使用许可证号为SYXK（沪）2016-0020。

1.2 实验方法

1.2.1 定量PCR 用不同浓度TSN（0、0.5、1.0 和2.0 μmol/L） 处理胃癌细胞BGC-823 24 h 后，TRIzol 提取总RNA，并通过M-MLV 反转录酶合成cDNA，使用SYBR Green Master Mixture 试剂盒进行cDNA 扩增。circDLST 上、下游引物序列分别为5'-TACAGTCAAAACCCCAGCGT-3'和5'-GTTGTTAATGCTTTCTCCCACC-3'。 以 人β 肌 动蛋白（β-actin）为内参对照，上、下游引物序列分别为5'- GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3'和5'-CCTGTAAC AACGCATCTCATATT-3'。每个样品重复3 次。

1.2.2 MTT 增殖实验 将circDLST 过表达及其空载对照（CON）慢病毒载体转染胃癌细胞BGC-823，具体转染方法参考文献[11]。细胞在96 孔培养板中培养，密度为5×103/孔。细胞贴壁48 h 后，以0.5 μmol/L TSN 处理细胞。每隔24 h 分析细胞增殖活性，加入20 μL MTT（5 mg/mL）孵育4 h 后，加入150 μL 二甲基亚砜溶解5 min，使用酶标分析仪在570 nm 处检测吸光度值。实验分为circDLST+TSN组、CON+TSN 组和CON+PBS 组，重复3 次。

1.2.3 Transwell 侵袭实验 将circDLST 过表达及其空载对照慢病毒载体转染胃癌细胞BGC-823，细胞贴壁48 h后，以0.5 μmol/L TSN 处理细胞24 h。使细胞悬浮在无血清培养基中饥饿24 h 后，将悬浮细胞添加到含有基质凝胶（3.9 μg/μL）的上层小室；而下层小室含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基。最后穿过凝胶的细胞用75%乙醇固定，并用结晶紫进行染色。光学显微镜下对每组挑选3 个视野进行细胞计数，实验分为circDLST+TSN 组、CON+TSN 组和CON+PBS 组，重复3 次。

1.2.4 裸鼠皮下移植瘤模型建立 将circDLST 过表达及其空载对照慢病毒载体转染胃癌细胞BGC-823 后，皮下注射接种（1×107/只），建立裸鼠皮下移植瘤动物模型。12 d 后，将模型裸鼠随机分为3 组：circDLST+TSN 组（n=6），circDLST 转染的胃癌细胞BGC-823 建立裸鼠皮下移植瘤后，每日腹腔注射200 μg/kg TSN[3]；CON+TSN组（n=6），CON 转染的胃癌细胞BGC-823 建立裸鼠皮下移植瘤后，每日腹腔注射200 μg/kg TSN；CON+PBS 组（n=6），CON 转染的胃癌细胞BGC-823 建立裸鼠皮下移植瘤后，每日腹腔注射等量的PBS。每隔1 日用游标卡尺测量裸鼠皮下肿瘤的长径（a）和短径（b），计算肿瘤体积V=1/2ab2。注射32 d 后处死各组裸鼠。动物研究获得上海交通大学附属第六人民医院动物实验室的伦理许可。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 TSN 对胃癌细胞中circDLST 表达的影响

利用不同浓度TSN（0、0.5、1.0 和2.0 μmol/L）处理胃癌细胞24 h 后，定量PCR 结果（图1）显示，与对照组（0 μmol/L）比较，TSN 明显下调circDLST 的表达水平，且呈浓度依赖性（均P＜0.01）。

2.2 TSN 通过调节circDLST 对胃癌细胞增殖活性的影响

之前的研究[11]已报道circDLST 过表达载体在BGC-823 胃癌细胞具有高的转染效率。circDLST 过表达载体或空载体转染胃癌细胞后，以0.5 μmol/L TSN 处理。MTT增殖实验结果（图2）显示，与CON+PBS 组比较，TSN作用72 h 后可显著抑制胃癌细胞增殖活性（均P=0.000）；而与CON+TSN 组比较，过表达circDLST 可逆转TSN 抗胃癌细胞增殖活性的作用（P=0.000）。

图2 circDLST 对TSN 抗胃癌细胞增殖活性的逆转效果Fig 2 Reverse effect of circDLST on the anti-proliferation activity of TSN in gastric cancer cells

2.3 TSN 通过调节circDLST 对胃癌细胞侵袭能力的影响

Transwell 侵袭实验（图3）显示，与CON+PBS 组比较，TSN 可显著抑制胃癌细胞的侵袭能力（P=0.000）；而与CON+TSN 组比较，过表达circDLST 可逆转TSN 抗胃癌细胞侵袭能力的作用（P=0.000）。

图3 circDLST 对TSN 抗胃癌细胞侵袭能力的逆转效果Fig 3 Reverse effect of circDLST on the anti-invasion potential of TSN in gastric cancer cells

2.4 TSN 通过调节circDLST 对胃癌皮下移植瘤生长的影响

circDLST 过表达载体或空载体转染BGC-823 细胞后皮下注射裸鼠，然后每日腹腔注射TSN 或PBS。结果（图4）显示，注射32 d 后，与CON+PBS 组比较，TSN可显著抑制胃癌细胞皮下移植瘤的生长（P=0.000）；而与CON+TSN 组比较，过表达circDLST 可逆转TSN 抗胃癌皮下移植瘤生长的作用（P=0.020）。

图4 circDLST 对TSN 抗胃癌皮下移植瘤生长的逆转效果Fig 4 Reverse effect of circDLST on the anti-xenograft tumor growth of TSN in gastric cancer cells

3 讨论

肿瘤侵袭转移是导致胃癌患者不良预后的主要原因之一。最近研究[12]显示，circRNA 异常表达与胃癌生存、转移及不良预后密切相关。circRNA 主要包括外显子circRNA、外显子内含子circRNA（exon-intron circRNA，EIciRNA）和内含子circRNA，其中外显子circRNA 占绝大多数。circRNA 的环状结构赋予了它们独特的生物学特性，如稳定性较强。circRNA 还能与miRNA 及蛋白质竞争性结合，参与蛋白质编码和转录调节[13]。研究[10-13]发现，circ-102958、circ-0000520、circ-0001017 可能对早期胃癌具有潜在的诊断价值；circLARP4、circPSMC3、circDLST的异常表达与胃癌的发生发展密切相关。我们前期研究[11]亦发现，circDLST 作为外显子circRNA 主要定位在胃癌细胞的细胞质，其异常上调可促进胃癌细胞的侵袭转移，并与患者的不良预后相关，提示其可能成为判断胃癌患者预后的潜在标志物。

本研究发现，不同浓度TSN 对胃癌细胞中circDLST表达具有抑制作用；同时TSN 可抑制胃癌细胞增殖活性、侵袭潜能和皮下移植瘤生长，而过表达circDLST 对TSN 的抗肿瘤效果具有逆转作用。因此，提示TSN 可能通过下调circDLST 抑制胃癌细胞增殖和侵袭；但是TSN对circDLST 下游的miRNA 及信号通路的调节作用仍有待进一步的探究，以期为其抗胃癌作用提供更多的实验 依据。

参·考·文·献

[1] Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin, 2018, 68(6): 394-424.

[2] Chen WQ, Zheng RS, Zhang SW, et al. Cancer incidence and mortality in China, 2013[J]. Cancer Lett, 2017, 401: 63-71.

[3] Wang G, Feng CC, Chu SJ, et al. Toosendanin inhibits growth and induces apoptosis in colorectal cancer cells through suppression of AKT/GSK-3β/β-catenin pathway[J]. Int J Oncol, 2015, 47(5): 1767-1774.

[4] Wang G, Huang YX, Zhang R, et al. Toosendanin suppresses oncogenic phenotypes of human gastric carcinoma SGC-7901 cells partlyviamiR-200a-mediated downregulation of β-catenin pathway[J]. Int J Oncol, 2017, 51(5): 1563-1573.

[5] Ju JM, Qi ZC, Cai XT, et al. Toosendanin induces apoptosis through suppression of JNK signaling pathway in HL-60 cells[J]. Toxicol In Vitro, 2013, 27(1): 232-238.

[6] Jeck WR, Sorrentino JA, Wang K, et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats[J]. RNA, 2013, 19(2): 141-157.

[7] Lai ZY, Yang Y, Yan YC, et al. Analysis of co-expression networks for circular RNAs and mRNAs reveals that circular RNAs hsa_circ_0047905, hsa_circ_0138960 and has-circRNA7690-15 are candidate oncogenes in gastric cancer[J]. Cell Cycle, 2017, 16(23): 2301-2311.

[8] Zhang Y, Liu H, Li WD, et al. CircRNA_100269 is downregulated in gastric cancer and suppresses tumor cell growth by targeting miR-630[J]. Aging (Albany NY), 2017, 9(6): 1585-1594.

[9] Ding LX, Zhao YY, Dang SW, et al. Circular RNA circ-DONSON facilitates gastric cancer growth and invasionviaNURF complex dependent activation of transcription factor SOX4[J]. Mol Cancer, 2019, 18(1): 45.

[10] Zhang J, Liu H, Hou LD, et al. Circular RNA_LARP4 inhibits cell proliferation and invasion of gastric cancer by sponging miR-424-5p and regulating LATS1 expression[J]. Mol Cancer, 2017, 16(1): 151.

[11] Zhang J, Hou LD, Liang R, et al. CircDLST promotes the tumorigenesis and metastasis of gastric cancer by sponging miR-502-5p and activating the NRAS/MEK1/ERK1/2 signaling[J]. Mol Cancer, 2019, 18(1): 80.

[12] Wang S, Tang D, Wang W, et al. CircLMTK2 acts as a sponge of miR-150-5p and promotes proliferation and metastasis in gastric cancer[J]. Mol Cancer, 2019, 18(1): 162.

[13] Ruan Y, Li Z, Shen YJ, et al. Functions of circular RNAs and their potential applications in gastric cancer[J]. Expert Rev Gastroenterol Hepatol, 2020, 14(2): 85-92.