严宇青，沈超琴，陈豪燕，洪 洁，王震华

上海交通大学医学院附属仁济医院消化科，上海市消化疾病研究所，上海 200001

研究[1-2]显示，结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的发病率及病死率分别位居恶性肿瘤的第3、4 位，是常见的消化系统恶性肿瘤，也是导致癌症死亡的第二大病因。CRC 患者的死亡与病灶转移密切相关，据统计患者因转移而发生死亡的数量分别占初诊和确诊人数的25%和50%[3]。对于CRC 转移的患者，切除原发灶和转移灶是最佳的治疗方案，但由于癌症细胞的潜伏性、播散性和抗药性，患者于术后复发十分常见[4]。因此，对CRC 转移的具体机制及其诊治标志物的研究，已成为当前关注的焦点。

在人类基因组中，细胞仅利用其中的2%来产生具有蛋白质编码功能的转录本，其余大部分不编码蛋白质的基因则被转录为非编码RNA。其中，长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是长度大于200 个核苷酸的非编码转录本[5]。lncRNA 可定位在胞核内或胞质中。在分子水平上，lncRNA 通过不同机制调节染色质组成、基因转录和转录后修饰[6]。在许多肿瘤尤其是恶性肿瘤中，如胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌等[7-10]，lncRNA 的表达可发生改变。

基于此，我们假设有特定lncRNA 参与CRC 的转移，通过筛选CRC 相关的lnc-MTBP-5，就该lncRNA 对人CRC 细胞侵袭能力的影响进行检测，以期为CRC 的早期诊断及治疗提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1 数据收集

1.1.1 数据集获取 从SRA（Sequence ReadArchive）数据库中提取PRJNA218851 数据集和PRJNA376161 数据集。前者包括18 例CRC 患者的正常结肠黏膜、CRC 原发灶及肝转移灶的数据，后者包括10 对肿瘤组织和正常结肠组织、5 对异常隐窝灶和匹配普通隐窝灶的数据。SRA数据库信息均采用R3.5.2 软件提取，用以筛选与CRC 转移相关的lncRNA。

1.1.2 组织芯片数据获取 在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中提取含有638 例CRC 组织芯片和51 例正常结直肠组织芯片的数据，分析lnc-MTBP-5在正常结直肠组织和CRC 组织中的表达差异。根据lnc-MTBP-5在CRC 患者癌组织表达量的中位数，将TCGA 数据库中的638 例患者分为lnc-MTBP-5高表达组和lnc-MTBP-5低表达组。从TCGA 数据库中提取CRC 患者的临床信息，包括初次病理诊断年龄、性别、美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）临床分级、淋巴结转移、远处转移、脉管侵及、结肠息肉病史和治疗后复发，分析lnc-MTBP-5与患者临床预后的相关性。TCGA 数据库CRC 组织芯片信息均采用R3.5.2软件提取。

1.2 标本收集

选择2016 年1 月—2017 年12 月于上海交通大学医学院附属仁济医院的53 例CRC 手术患者，从癌组织和癌旁组织获取标本，并于-80 ℃长期保存。本研究经上海交通大学医学院附属仁济医院伦理委员会批准（伦理审批号为[2015]097），所有参与者均签署了知情同意书。

1.3 细胞和主要试剂

人正常结直肠黏膜FHC 细胞以及人CRC 细胞HT29、SW480、DLD1、HCT116、SW1116、Lovo、RKO 和Caco2 均购自美国模式菌种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

RPMI-1640 培养液、McCoy's 5A 培养液、OptiMEM培养液和胎牛血清均购自美国Gibco 公司，DharmaFECT 1 转染试剂购自美国GE Healthcare 公司，RNAiso Plus、反转录试剂和实时荧光定量PCR 试剂盒均购自日本TaKaRa公司，PCR 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，CCK-8 检测试剂盒购自日本同仁化学研究所，Transwell 小室购自美国Millipore 公司，Matrigel 胶购自美国BD Bioscience 公司。

1.4 CRC 细胞培养及转染实验

分别采用含5%胎牛血清的McCoy's 5A 完全培养基和RPMI-1640 完全培养基，于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养HT29、SW480 细胞，于3 d 后传代。待细胞生长至指数生长期时，分别以3×105个/孔、2×105个/孔接种于6 孔板中，用于后续转染。

用Control siRNA、lnc-MTBP-5siRNA 分 别 转 染HT29 和SW480 细胞，并用正常表达lnc-MTBP-5的质粒（pcDNA3.1）、lnc-MTBP-5过表达质粒（pcDNA3.1-lnc-MTBP-5）分别转染SW480 细胞。于6 孔板中继续分别培养上述细胞24 h 后，将培养液更换为无血清培养基。于37 ℃培养6 h 后将培养基更换为完全培养基，继续培养细胞48 h 后提取RNA，用于后续研究。转染实验siRNA 序列见表1。

表1 siRNA 序列Tab 1 Sequence of siRNA

1.5 细胞和组织中lnc-MTBP-5 的表达量检测

采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）检测lnc-MTBP-5的表达量。采用磷酸盐缓冲液洗涤FHC 细胞、8 种CRC 细胞及转染的HT29、SW480 细胞各2 次，同时将53 例结直肠癌组织和癌旁组织标本研磨成粉末后，按照操作说明抽提总RNA。细胞质/细胞核RNA 抽提按照试剂盒说明操作。分别取1 μg 上述RNA，用PrimeScript RT Reagent Kit 试剂盒反转录成cDNA，并以此为模板用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒、StepOne real-time PCR 系统进行qPCR 检测。反应条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40 个循环。以2-△△CT值评估基因的相对表达量，每组实验设置3 个复孔。细胞、组织中总表达量的检测以GAPDH为相对内参，细胞质和细胞核内表达量检测以U6为相对内参。引物序列见表2。

表2 PCR 引物序列Tab 2 Primer sequences for PCR

1.6 细胞增殖能力检测

采用CCK8 实验检测CRC 细胞的增殖能力。将HT29、SW480 细胞接种至96 孔板中，按1.4 方法分别转染Control siRNA 和lnc-MTBP-5siRNA。分别在转染后的第0、1、2、3、4 日，向每孔加入100 μL 含10% CCK8试剂的无血清培养基，于37 ℃孵育2 h 后，用酶标仪测定样品在450 nm 处的吸光度。

1.7 细胞克隆形成能力检测

采用克隆形成实验检测CRC 细胞的增殖能力。将HT29、SW480 细胞以800 个/孔接种至6 孔板中，按1.4方法分别转染Control siRNA 和lnc-MTBP-5siRNA，并静置于培养箱中。7 d 后弃去培养基，经固定染色后拍照，观察克隆形成的大小和数量。

1.8 细胞侵袭能力检测

采用侵袭实验检测SW480 细胞的侵袭能力。将SW480 细胞按2×105个/孔接种于6 孔培养板中，培养24 h 后向其中分别转染Control siRNA 和lnc-MTBP-5siRNA，以及对照质粒和lnc-MTBP-5过表达质粒。继续培养24 h 后进行消化，并用无血清RPMI-1640 培养液重悬细胞。在24 孔培养板中放入Transwell 小室，铺入40 μL Matrigel；4 ～6 h 后向小室下层加入600 μL 含20%胎牛血清的RPMI-1640 培养液，小室上层加入200 μL 上述4 组细胞悬液。继续培养48 h 后取出小室，固定染色并于光学显微镜下进行观察。随机选取4 个视野（放大倍数为40 倍），计数穿过Matrigel 的细胞数，取平均值。

1.9 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对研究数据进行统计分析，所有实验均重复3 次。组间比较采用配对t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SRA 数据库中与CRC 转移相关的lncRNA 分析

采用t检验对PRJNA218851 数据集进行分析，共获得105 条[假发现率（false discovery rate，FDR）＜0.05）]在正常-原发灶-转移灶中依次表达上调的lncRNA；在PRJNA376161 数据集中，对10 对肿瘤组织和癌旁正常组织的数据分析得到990 条（FDR＜0.05）差异表达lncRNA。对上述lncRNA 取交集，共得到10 条在2 个数据集中均有意义的lncRNA。通过在UCSC（http://genome.ucsc.edu/）中比对序列，我们将关注点放在ENSG00000254814、ENSG00000257453 和ENSG00000272502 这3 条lncRNA上，筛选流程如图1A。由于前2 条lncRNA 的引物未能成功合成，因此仅重点研究ENSG00000272502。通过在LNCipedia 数据库（https://lncipedia.org/）中对该lncRNA的编码潜能进行验证（排除假阳性），最终确认其（lnc-MTBP-5）是一种非编码RNA（图1B）。

在正常肠上皮细胞和8 个结直肠癌细胞系中对lnc-MTBP-5表达量进行检测，结果显示lnc-MTBP-5在5 个结直肠癌细胞中的表达均显著高于FHC 细胞（图1C）。通过对HT29、SW480 细胞的胞质和胞核RNA 进行分离发现，lnc-MTBP-5在胞质、胞核中均有分布（图1D、E）。

图1 SRA 数据库中与CRC 转移相关的lncRNA 分析Fig 1 Analysis of lncRNAs related to CRC metastasis in SRA database

2.2 lnc-MTBP-5 在CRC 患者癌组织和癌旁组织中的表达差异

为了探讨lnc-MTBP-5与CRC 的临床相关性，本研究对53 例结直肠癌组织和癌旁组织标本中lnc-MTBP-5的表达进行检测，结果（图2A）显示癌组织中lnc-MTBP-5的表达显著高于癌旁组织（P=0.000）。进一步针对TCGA数据库中638 例癌组织和51 例正常组织中的lnc-MTBP-5表达进行评估，结果（图2B）显示癌组织中其表达高于正常组织（P=0.000）。继而提示，lnc-MTBP-5的高表达可能参与了CRC 的发生和发展。

2.3 CRC 组织中lnc-MTBP-5 表达与患者临床预后的关系

为进一步验证lnc-MTBP-5与CRC 的临床相关性，本研究发现在TCGA 数据库的638 例患者中，lnc-MTBP-5表达的高低与患者的初次病理诊断年龄（P=0.020）、临床分期（P=0.006）、淋巴结转移情况（P=0.017）、远处转移情况（P=0.033）有关（表3）；且与低表达组相比，lnc-MTBP-5高表达组中初次病理确诊年龄小于65 岁以及临床分期为Ⅲ、Ⅳ期的患者居多，且易发生淋巴结转移和远处转移。

图 2 lnc-MTBP-5 在正常结直肠组织与CRC 组织中的表达Fig 2 Expressions of lnc-MTBP-5 in CRC tissues and normal colorectal tissues

表3 CRC 患者中lnc-MTBP-5 表达与临床信息的关系Tab 3 Relationship between lnc-MTBP-5 expression and clinical information in patients with CRC

2.4 lnc-MTBP-5 对CRC 细胞侵袭能力的影响

为评估lnc-MTBP-5在CRC 发生与发展中的生物学功能，本研究通过向HT29、SW480 细胞中转染lnc-MTBP-5siRNA 发现，lnc-MTBP-5的表达量显著下降；而在SW480细胞中转染pcDNA3.1-lnc-MTBP-5后发现，lnc-MTBP-5的表达量显著升高（图3A ～C）。随后，进一步开展功能实验发现，在HT29 和SW480 细胞中转染lnc-MTBP-5siRNA后，与转染Control siRNA 的细胞相比，前者的增殖和克隆形成能力无明显差异（图3D、E）。因HT29 是高分化型CRC 细胞系，侵袭能力较弱，侵袭功能实验仅选择低分化的SW480 细胞系进行。侵袭实验结果表明，经lncRNA siRNA 转染的SW480 细胞穿过Transwell 小室的数量少于经Control siRNA 转染的细胞（图3F）。相反，与转染对照质粒的SW480 细胞相比，上调lnc-MTBP-5后，SW480 细胞侵袭能力增强（图 3G）。以上结果表明，lnc-MTBP-5可以增强SW480 细胞的侵袭能力，但对HT29 和SW480 细胞的增殖和克隆形成能力无明显影响。

2.5 lnc-MTBP-5 与转移起始基因表达的相关性

转移起始基因的缺失或过表达均能促使细胞外基质的降解、细胞黏附的减少、细胞侵袭能力的增强、血管生成以及肿瘤微环境的改变[11]。为进一步探索lnc-MTBP-5的作用机制，本研究对TCGA 数据库中lnc-MTBP-5的表达与转移起始基因的表达做相关性分析。结果（图4）显示，lnc-MTBP-5与结肠癌转移相关因子1（metastasis associated in colon cancer 1，MACC1）呈正相关；经进一步探索其下游机制发现，lnc-MTBP-5与间质上皮转换因子（mesenchymal to epithelial transition factor，MET）、钙黏着蛋白关联蛋白（cadherin-associated protein，CTNNB1）均呈正相关，而与肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）均无明显正相关性。继而提示，lnc-MTBP-5促进CRC 的转移可能与MACC1 激活HGF/MET 通路及其下游AKT/CTNNB1 通路有关。

图3 lnc-MTBP-5 在CRC 发生与发展中的生物学功能Fig 3 Biological function of lnc-MTBP-5 in the occurrence and development of CRC

图4 lnc-MTBP-5 与转移相关基因表达的相关性分析Fig 4 Correlation analysis of lnc-MTBP-5 and the expression of metastasis associated genes

3 讨论

研究[12-13]显示，CRC 的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，且其病灶转移是CRC 患者死亡的主要原因。因此，针对CRC 转移的早期检测，并寻找有效的分子标志物成为近年来预防和治疗CRC 的关键点。

已有研究报道，CRC 的转移与许多分子标志物相关，如JMJD2C、FOXC1、SGK1、RHBDD1[14-17]。同时，非编码RNA 也被广泛报道参与了CRC 转移的发生。依据RNA 长度的不同，非编码RNA 被分为两类；其中，小于200 个核苷酸的转录本被称为microRNA，通常在转录后调节基因的表达；而大于200 个核苷酸的转录本被称为lncRNA，该类RNA 具有较强的组织和细胞表达特异性，参与调节多种重要的细胞活动，如募集染色质修饰物（HOTAIR）[18]、调节X 染色体基因表达（XIST）[19]、调节基因组表达和蛋白质活性等。此外，lncRNA 还具有结构相对稳定，易于在血液和尿液中被检测，且定量方法灵敏、快速、成本低廉等优势[20]，使得该类RNA 可作为癌症初筛、早期诊治的分子标志物，具有较强的应用价值。

在本研究中，通过整合分析2 个SRA 数据集的数据，筛选出在正常-原发灶-转移灶中表达依次上调的lncRNA，通过结合文献以及细胞实验、临床标本信息的验证，我们选择了lnc-MTBP-5继续研究；结果显示，该lncRNA 在多个CRC 细胞系和CRC 组织中均呈高表达。同时，本研究通过提取TCGA 数据库中CRC 患者的临床信息进行研究，结果显示lnc-MTBP-5的表达量与患者预后紧密相关。继而推测，lnc-MTBP-5或可作为早期预警和诊断CRC 的分子标志物；由于高表达lnc-MTBP-5的患者易发生CRC 转移，临床医师应在患者早期给予积极治疗，手术后密切随访。

CRC 的肝转移是影响患者预后的重要危险因素之一，因此揭示CRC 转移的发生机制亦是改善患者预后的关键点。本研究通过下调lnc-MTBP-5的表达发现，SW480 细胞的侵袭能力减弱，继而证实lnc-MTBP-5的高表达可提高CRC 的转移能力。

先前已有研究表明lncRNA 在CRC 中呈现异常表达，但有关其在CRC 转移中的作用及机制仍知之甚少。目前，基于lncRNA 在序列、结构以及生物功能上的高度异质性，存在有多种lncRNA 的分类方法，如根据亚细胞定位可将lncRNA 分为细胞核lncRNA 与细胞质lncRNA。lncRNA 的亚细胞定位与其功能密切相关，如在细胞质中lncRNA 可作为竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）与microRNA 竞争性结合，调节miRNA抑制的靶基因表达[21]。已有研究[22]报道，lncRNAUICLM通过竞争性结合miR-215 来调节其下游ZEB2的表达，进而促进CRC 的肝转移。lncRNAXIST可直接结合miR-200b-3p，调节其下游ZEB1的表达，从而促进CRC 细胞的增殖、侵袭、上皮间充质转化及小鼠模型中肿瘤的生长和转移[23]。考虑到本研究中lnc-MTBP-5在胞质、胞核均有分布，我们推测lnc-MTBP-5可通过竞争性结合相关microRNA，调节下游靶基因的表达，促进CRC 的转移。

癌症的转移是一个复杂的过程，包括细胞外基质的降解、细胞黏附性的降低、癌细胞的黏附性增加和肿瘤微环境的改变等[24-28]，是许多肿瘤发展、侵袭的重要过程[29-30]。根据在转移中所起的作用，与转移相关的基因可分为促癌基因、转移起始基因、转移进展基因和转移毒力基因[11]。转移起始基因MACC1已被证实在恶性肿瘤组织中有较高的表达，尤其在发生转移的恶性组织中。MACC1可通过结合Met的启动子区，激活HGF/MET 通路，进而促进肿瘤的增殖、上皮间质转化、血管生成、侵袭转移、调节细胞代谢和凋亡[31-32]。HGF/MET 通路的激活可使其下游的相应信号通路被激活，如通过TWIST/VEGF 通路促进血管生成，激活Nanog 分子增强细胞干性，激活STAT1/3、MCL1/FAS调节细胞凋亡和免疫重建。其中，AKT/CTNNB1 通路是HGF/MET 通路促进肿瘤转移的中间信号通路。本研究初步分析了TCGA 数据库中lnc-MTBP-5与转移相关基因表达的相关性，并发现lnc-MTBP-5促进CRC 的转移可能与MACC1 激活HGF/MET通路及其下游AKT/CTNNB1 通路有关。结合lnc-MTBP-5在胞质、胞核的分布，我们推测lnc-MTBP-5可能通过竞争性结合microRNA 提高MACC1 的表达，进而激活下游AKT/CTNNB1 通路。而其具体机制还有待实验进一步 探究。

综上所述，lnc-MTBP-5在CRC 中表达增加，且其高表达与患者预后呈负相关；同时，lnc-MTBP-5可促进CRC 细胞的侵袭。因此，lnc-MTBP-5或可作为临床评估CRC 发生与发展、远处转移的新型肿瘤标志物，其相关信号通路及分子机制亦将是我们下一步的研究重点。随着研究的不断深入，lnc-MTBP-5或可为临床预防、治疗CRC 及相关预后评估提供更加广阔的前景。

参·考·文·献

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