何广铭 罗文安 程学仁 魏 梅

（广东一方制药有限公司， 广东 佛山528244）

麻杏石甘汤出自《伤寒论》，由麻黄、炙甘草、石膏、苦杏仁4 味中药组成，具有镇咳、解热、抗炎、抑菌等作用［1］，目前广泛用于中医临床各种呼吸系统疾病，如慢性支气管炎、肺炎、小儿肺热咳喘、上呼吸道感染等［2］，方中成分复杂多样，如麻黄中生物碱、黄酮［3⁃5］，甘草中皂苷、黄酮［6⁃7］，苦杏仁中苦杏仁苷、精油［8⁃9］，并且各化合物之间紫外吸收差异较大，对其质量的全面控制造成一定的困难。本实验采用分离能力较强的UPLC 法对麻杏石甘汤中各成分进行有效分离，并且通过全波长扫描及多波长切换形式来最大程度采集相关色谱信息，以期对方中每味饮片的特征成分及全方质量提供更全面有效的控制方法。

1 材料

1.1 仪器 Thermo Vanquish 超高效液相色谱仪，配置二极管阵列检测器（美国Thermo 公司）；Waters LC⁃MS 液质联用仪，配置LC⁃ACQUITY UPLC H⁃Class、MS⁃Waters Xevo TQD MS（美国Waters 公司）；KQ⁃500DE 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ME204E（万分之一）、XP26（百万分之一）电子天平（瑞士梅特勒⁃托利多公司）。

1.2 试剂与药物 甘草苷（批号111610⁃201607，纯度93.1%）、苦杏仁苷（批号110820⁃201607，纯度90.7%）、甘草酸铵（批号110731⁃201418，纯度93.1%）、伪麻黄碱（批 号 171237⁃201209，纯 度 99.9%）、麻黄碱（批 号171241⁃201508，纯度99.8%）对照品均购于中国食品药品检定研究院。色谱纯乙腈、甲醇（美国默克公司）；色谱纯三乙胺、磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）；分析纯甲醇（广州化学试剂厂）；超纯水（自制）。

1.3 饮片 麻黄（编号MH01、MH02、MH03）、苦杏仁（编号KXR01、KXR02、KXR03）、炙甘草（编号ZGC01、ZGC02、ZGC03）、石膏（编号SG01、SG02、SG03）各3批，均购于广东一方制药有限公司；麻杏石甘汤（2.5 倍处方量）2 批，分别购于同仁堂药店、丹枫药店，并由驻店药师进行调配，以上药材均经专家鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 实验室、药店煎液制备 按照2009 年发布的《医疗机构中药煎药室管理规范》 相关规定，并参考《方剂学》剂量［10］，称取2.5 倍处方量饮片（麻黄22.5 g、苦杏仁22.5 g、炙甘草15.0 g、石膏45.0 g），置于自动电陶瓷壶中加水煎煮2 次。第1 次将麻黄与其余3 种饮片分为2 份，加800 mL 水浸泡30 min，将除麻黄外的3 种饮片取出，武火（500 W）加热至沸腾后转文火（200 W）微沸10 min，再回加其余3 种已浸泡的饮片继续微沸30 min，煎液采用350 目筛网趁热过滤，滤液迅置于冷水中冷却；第2 次加600 mL 水，武火加热至沸腾后转文火微沸25 min，煎液同样采用350 目筛网趁热过滤，迅速置于冷水中冷却，合并2次冷却后的煎液，混匀，即得3 批实验室、2 批药店调配饮片的煎液，备用。

2.2 医院药房煎液制备 分别采用不同批次、产地的饮片进行组方（2.5 倍处方量），并按照《医疗机构中药煎药室管理规范》 相关规定进行煎煮，加水量、煎煮次数与“2.1” 项下实验室煎煮方法相同，即得10 批医院药房煎液，均由广东省中西医结合医院提供，

2.3 色谱条件 Waters Xbridge BEH phenyl 苯基柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相［乙腈⁃甲醇（40 ∶60）］（A）⁃0.1%磷酸（含0.1%三乙胺）（B），梯度洗脱，程序见表1；体积流量0.2 mL／min；检测波长210 nm（0～36.5 min）、255 nm（36.5 min）。

2.4 供试品溶液制备 精密量取上述煎液各5 mL，置于10 mL 量瓶中，适量甲醇摇匀并定容至刻度，超声（250 W、33 kHz）处理30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

表1 梯度洗脱程序

2.5 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，50%甲醇制成质量浓度适宜的溶液，即得。

2.6 检测波长筛选 精密吸取供试品溶液1 μL，在“2.3” 项色谱条件下进样测定，截取有明显吸收信息的200～270 nm 波长段等值图。结果，在210 nm 波长附近集中了大部分紫外吸收信息，而35 min 后在255 nm 左右也有部分较大的吸收信息，而且背景吸收对其影响较小，故确定在36.5 min 将210 nm 切换至255 nm。

2.7 方法学考察

2.7.1 精密度试验 精密吸取供试品溶液1 μL，在“2.3” 项色谱条件下进样测定6 次，测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD 均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.7.2 稳定性试验 取1 份煎液，按“2.4” 项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、16、24 h 在“2.3”项色谱条件下各进样1 μL 测定，测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD 均小于2.0%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7.3 重复性试验 取同一份煎液，按“2.4” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下各进样1 μL 测定，测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD均小于2.0%，表明该方法重复性良好。

2.8 共有峰确定及相似度评价 取3 批自由组合、2 批药店饮片调配、10 批医院提供的煎液，按“2.4” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样测定，将数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2012，130723）》 系统进行共有峰匹配，以6 号峰为参照（S），得共有峰对照图谱和信息。结果，确定了9 个共有峰，15批样品中其相对保留时间RSD 均小于0.1%，而相对峰面积的RSD 差异较大，见图1～2、表2～3。再以对照特征图谱为参照，计算15 批样品的相似度，发现均在0.9 以上，见表4。

图1 15 批样品UPLC 特征图谱

图2 UPLC 特征图谱共有峰

表2 15 批样品相对保留时间

表3 15 批样品相对峰面积

表4 15 批样品相似度

2.9 特征峰归属与指认 按“2.1” 项下方法制备缺各饮片的阴性煎液，按“2.4” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样测定，结果见图3。由此可知，峰1、2、4 归属于麻黄，峰5、6 归属于苦杏仁，峰3、7、8、9 归属于炙甘草。

通过比对对照品保留时间、紫外光谱信息、质谱（参数见表5），确定峰1 为麻黄碱，峰2 为伪麻黄碱、峰6 为D⁃苦杏仁苷、峰7 为甘草苷、峰9 为甘草酸。其中，峰5、6 相对分子质量均为457.4（图4），参考文献［11⁃12］，初步判断峰5 可能为D⁃苦杏仁苷的差向异构体L⁃苦杏仁苷。

图3 各成分UPLC 色谱图

表5 质谱参数

3 讨论

3.1 处方量及煎煮方式筛选 本实验处方量主要参考李飞主编《方剂学》 中麻杏石甘汤的（麻黄9 g、苦杏仁9 g、炙甘草6 g、石膏18 g）。再参考《医疗机构中药煎药室管理规范》 中的煎煮方法，选择3 L 陶瓷壶、2.5 倍处方量，加水使液面浸过药面2～5 cm，煎煮2 次，煎液过滤后合并，可使煎液更贴近医院临床实际应用。

图4 苦杏仁苷质谱图（m／z 456.4）

3.2 供试品溶液制备方法筛选 本实验考察了不同提取溶剂［甲醇、水、甲醇（含1.44%磷酸）］、超声时间（20、30、40 min），发现甲醇、甲醇（含1.44%磷酸）提取时在3 种超声时间下的总特征峰面积无明显差异，并且明显高于水提取时，其原因是只加水超声后麻黄中色谱峰4，甘草中甘草苷、甘草酸色谱峰的峰面积明显低于含甲醇溶剂提取后，为了保证提取完全及成本因素，最终选择甲醇超声提取30 min 作为供试品溶液制备方法。

3.3 色谱条件筛选 本实验在保证各成分提取最大化的基础上，采用UPLC 法将其分离，并进行全波长扫描，选择紫外吸收最大的波长进行多波长切换检测。再以麻杏石甘汤中每个药味主要成分的色谱峰为特征峰，对其进行归属及UV、MS 质谱指认，可在同一色谱条件下较全面地反映了方中各药味特征成分，而且该条件下无论是主成分检出数量，还是色谱峰分离效果，均较同类文献［13⁃15］有明显优势，能为全方质量控制提供了更为简便准确的方法。