HPLC 法同时测定甘草中3 种成分

2020-11-02靳雪飞何云娇施务务葛少波褚瑞萌

中成药 2020年10期

靳雪飞何云娇张杰施务务葛少波褚瑞萌

（1.蚌埠市第一人民医院中药房，安徽蚌埠233000； 2.安徽中医药大学第一附属医院药学部，安徽合肥230009）

甘草是临床常用中药，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的作用，被誉为“众药之王”，甘草苷、甘草酸、甘草次酸是其主要活性成分［1⁃2］，均为黄酮类化合物，具有解毒、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用，其中甘草苷、甘草酸具有增加免疫、保护阿尔茨海默脑、抗氧化、抗糖尿病、抗哮喘等活性，而甘草次酸为相对高效的抗癌成分，具有消炎、抗菌、抗感染、抗病毒、抗HIV、增强机体对毒物耐受等。

现有报道主要集中于对甘草有效部位提取分离的研究，以及对临床疗效的探讨，而对其活性成分准确测定的报道相对较少，并且也只针对其中一两个化合物，尚无同时对甘草苷、甘草酸、甘草次酸的有效快速定量检测。因此，本实验建立HPLC 法同时测定甘草中上述3 种成分的含有量，以期为市场上对该药材质量控制提供依据，也对相应制剂的制备具有重要意义［3⁃5］。

1 材料

HP⁃1100 高效液相色谱仪（北京科瑞迈科技有限责任公司）。甘草购自东营市益生堂医药连锁有限公司（批号160201、170401、170602），经专家鉴定为正品。甘草酸铵、甘草苷、甘草次酸对照品均由中国食品药品检定研究院提供，批号分别为 110731⁃200407、111610⁃201005、110723⁃201715。甲醇（批号 17065013）、乙腈（批号174488）为色谱纯（美国赛默飞世尔科技公司）；醋酸铵（批号171102）为分析纯（广州市三昌化工有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）⁃0.03 mmol／L 醋酸铵（B），梯度洗脱，程序见表1；体积流量1.0 mL／min；柱温28 ℃；检测波长327 μm（0～5 min）、237 nm（5～20 min）；进样量20 μL。色谱图见图1。

表1 梯度洗脱程序

图1 各成分HPLC 色谱图

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液精密称取饮片0.2 g，置于100 mL 圆形烧瓶中，加入50%甲醇100 mL，回流提取2 h 后在70 ℃下回收溶剂，放冷，称定质量，50%甲醇补足减失的质量，混匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液精密称取甘草酸胺、甘草苷、甘草次酸对照品适量，50%甲醇溶解稀释至刻度，即得，每1 mL分别含三者0.04、0.02、0.08 mg（甘草酸含有量＝甘草酸胺含有量／1.020 7）。

2.3 线性关系考察精密吸取对照品溶液5、10、15、20、25、30 μL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程分别为甘草酸Y＝25.841X-14.26（r＝0.998 0）、甘草苷Y＝22.197X＋10.374（r＝0.999 0）、甘草次酸Y＝18.722X-10.928（r＝0.999 0），分别在0.201～1.206、0.113～0.678、0.392～2.352 μg 范围内线性关系均良好。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验取对照品溶液20 μL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得甘草酸胺、甘草苷、甘草次酸峰面积RSD 分别为0.18%、0.42%、0.87%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验取同一份供试品溶液，于0、2、4、6、8、10 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得甘草酸胺、甘草苷、甘草次酸峰面积RSD 分别为0.91%、1.04%、1.48%，表明溶液在10 h 稳定性良好。

2.4.3 重复性试验取同一批饮片，按“2.2.1” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，测得甘草酸胺、甘草苷、甘草次酸峰面积RSD 分别为1.38%、1.49%、1.45%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 加样回收率试验精密称取各成分含有量已知的饮片6 份，每份0.2 g，置于100 mL 圆形烧瓶中，加入1 mL对照品溶液，按“2.2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，甘草酸、甘草苷、甘草次酸平均加样回收率分别为98.33%、99.43%、98.47%，RSD 分别为0.89%、0.47%、0.65%。

2.4.5 样品含有量测定取3 批饮片，每批6 份，按“2.2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表2，可知甘草苷、甘草酸含有量均符合2015 年版《中国药典》规定（分别不低于0.5%、2.0%）。

表2 各成分含有量测定结果（n＝6）

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法筛选本实验考察了50%甲醇、甲醇、50%乙醇，以及加热回流1、2、3 h 对各成分提取效果的影响，发现50%甲醇加热回流2 h 时各成分提取较完全，而且杂质峰较少，故选择其作为供试品溶液制备方法。

3.2 色谱条件筛选

3.2.1 色谱柱本实验考察了3 种不同厂家的Kromasil C18、YMC⁃ODS、Agilent SB⁃C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），结合方法耐用性、分离度、理论塔板数、综合对称因子等因素，最终选择Kromasil C18色谱柱。

3.2.2 流动相本实验以乙腈替代甲醇，赵建军等［6］报道它具有更好的洗脱能力。再通过查阅关于甘草酸、甘草苷含有量测定的文献，选择乙腈⁃0.03 mmol／L 醋酸铵作为流动相，同时不断优化其比例，发现按表1 程序梯度洗脱时分离效果好，干扰小，出峰时间短［7］。

3.2.3 检测波长参照2015 年版《中国药典》，本实验分别以327、237 nm 为第1、第2 检测波长，可提高检测的灵敏度和分析效率。

3.3 指标成分筛选甘草为豆科植物，被广泛用于抗炎、抗心血管疾病、抗病毒［8⁃9］，其所含甘草酸是重要成分，为无色柱状结晶体；甘草次酸是甘草酸水解成分，具有降压、抗炎、增强机体免疫功能作用，还作为五环三萜化合物制剂的原料用于抗肿瘤［10］；甘草苷为二氢黄酮类化合物，具有抗氧化、清除自由基作用，还能保护心肌细胞。因此，本实验选择上述3 种成分作为指标进行检测。