杨丹丹 许立拔 夏 星 吴思宇 王孝勋∗ 梁琼月

（1.广西中医药大学， 广西 南宁530200； 2.广西中医药大学壮瑶药重点实验室， 广西 南宁530200）

咳嗽是临床上很多疾病的症状，可由外源性或内源性刺激物刺激呼吸道黏膜，造成许多神经肽的释放，神经肽刺激感受器引起神经冲动，刺激咳嗽中枢，大脑皮质控制性失衡而产生咳嗽［1］。咳嗽是机体一种重要的防御反射，可清除呼吸道异物，但频繁剧烈或长时间的咳嗽会给患者工作、生活带来严重影响。《济世方·咳嗽》：“五脏六腑皆令人咳，非独肺也”，中医认为咳嗽 “必自肺而穿五脏”，五脏六腑功能失调，导致邪客于肺，均可引发咳嗽，故其病因很复杂［2］。

对叶百部为百部科植物对叶百部Stemona tuberosaLour.的干燥块根，有润肺下气止咳、杀虫灭虱之功效。课题组前期研究表明，广西不同产地对叶百部总生物碱对小鼠均有止咳作用，但具体机制尚不明确［3］。本实验考察对叶百部总生物碱对辣椒素致豚鼠咳嗽的影响，以期为相关新药开发和临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 动物 Dunkin Hartley 种白化豚鼠（DH 豚鼠），普通级，雌雄各半，雌性体质量251.1～323.8 g，雄性体质量293.8～392.4 g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，生产许可证号SCXK（湘）2014⁃0010，动物室符合普通级要求。

1.2 试剂与药物 对叶百部总生物碱由广西中医药大学壮瑶药重点实验室提供，酸性染料比色法测得其质量分数为82.15%。磷酸可待因（青海制药厂有限公司，批号20160915）；辣椒素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号G1502115）；羧甲基纤维素钠（CMC⁃Na，国药集团化学试剂有限公司，批号20160704）；磷酸盐缓冲液（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号20171012）；水合氯醛（成都市科隆化学品有限公司，批号2017091901）；4% 多聚甲醛（武汉贝茵莱生物科技有限公司，批号201803）；豚鼠P 物质（SP）酶联免疫检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20180627）。

1.3 仪器 KQ⁃500DA 型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；5810R 型冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；RCT B 型磁力搅拌器（德国IKA 公司）；BSA224S 型电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；SIM⁃F140AY65⁃PC 型制冰机（日本大阪松下电器产业株式会社）；FJ⁃200 型分散均质机（上海标本模型厂）；WH⁃2000型超声波雾化器（广东粤华医疗器械厂有限公司）；Infinite M200pro 型酶标仪（瑞士Tecan 公司）。

2 方法

2.1 对叶百部总生物碱制备 称取对叶百部粉末（过二号筛）1 kg，置于具塞锥形瓶中，精密加入10 L 甲醇超声40 min，放冷，摇匀，滤过，取滤液，旋转蒸发仪挥干溶剂，残渣加2 500 mL 4% 盐酸溶解，抽滤，滤去酸不溶性成分，滤液加氨水调至pH 9～10，析出沉淀，将沉淀与溶液一起移至分液漏斗，加4 L 氯仿萃取，取下层氯仿层清液，挥干溶剂，即得对叶百部总生物碱。取140 mg，研磨成细粉后加0.5% CMC⁃Na 至10 mL，充分混匀成混悬液，即得高剂量药液（14.0 mg／mL），同法配制低、中剂量药液（3.5、7.0 mg／mL），临用现配，给药时用磁力搅拌器充分混匀。

2.2 分组、造模与给药 60 只豚鼠随机分为正常组，模型组，对叶百部总生物碱低、中、高剂量组（5、10、20 mg／kg），磷酸可待因片组（10 mg／kg）［4］，每组10 只，按1.4 mL／kg 剂量灌胃给药，每天1 次，连续3 d，正常组、模型组给予等体积0.5%CMC⁃Na 溶液。记录给药前及给药结束豚鼠体质量，并计算其增长值。

2.3 咳嗽指标 豚鼠禁食不禁水12～14 h，末次给药后1 h先将超声波雾化器连接5 L（直径20 cm，高16 cm）带硅胶盖的密闭透明三角玻璃烧瓶罩中，开动雾化器调节到0.5 mL／min，使玻璃罩内充满雾化0.03 mol／L 辣椒素，除正常组不做任何处理外，其余各组豚鼠放入玻璃罩内，每个罩子1 只，继续喷雾120 s，记录10 min 内豚鼠咳嗽次数（咳嗽声响亮时进行）［5］，计算镇咳率，公式为镇咳率＝［（模型组咳嗽次数-给药组咳嗽次数）／模型组咳嗽次数］×100%。

2.4 采血与取材 检测咳嗽指标后，所有豚鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL／kg）麻醉，腹主动脉采血，4 ℃、3 000 r／min 下离心20 min，分离血清，分装冻存。采血后分离气管，肺左下叶置于4% 多聚甲醛中固定，HE 染色，用于组织病理学检测；同一部位分离肺右下叶组织100 mg，按1 ∶5 比例加入PBS 缓冲液（pH ＝7.4），迅速匀浆，4 ℃、3 000 r／min 下离心20 min，分离上清液，分装冻存［6］。ELISA 法检测血清及肺组织SP 水平，具体操作按试剂盒说明书进行；酶标仪在450 nm 波长处检测吸光度（OD），拟合标准曲线，计算结果。

2.5 统计学分析 通过SPSS21.0 软件进行处理，计量数据以（¯）表示，若符合正态分布和方差齐性，多组间比较采用单因素方差检验，组间两两比较采用LSD 检验；若不符合正态分布或方差齐性，多组间比较采用秩和检验，组间两两比较采用Mann⁃Whitney U 检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 对叶百部总生物碱对豚鼠体质量的影响 表1 显示，给药3 d 后与正常组比较，模型组豚鼠体质量及其增长程度均无明显变化（P＞0.05）；与模型组比较，对叶百部总生物碱各剂量组豚鼠体质量及其增长程度均无明显差异（P＞0.05）。

表1 对叶百部总生物碱对豚鼠体质量的影响（， n＝10）

表1 对叶百部总生物碱对豚鼠体质量的影响（， n＝10）

3.2 对叶百部总生物碱对咳嗽指标的影响 表2 显示，与模型组比较，对叶百部总生物碱各剂量组豚鼠咳嗽次数均减少（P＜0.01），高剂量组咳嗽潜伏期延长（P＜0.05），并且镇咳率与剂量呈正比。

表2 对叶百部总生物碱对咳嗽指标的影响（， n＝10）

表2 对叶百部总生物碱对咳嗽指标的影响（， n＝10）

注：与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.3 对叶百部总生物碱对豚鼠血清和肺组织SP 水平的影响 表3 显示，与正常组比较，模型组豚鼠血清和肺组织SP 水平均升高（P＜0.01）；与模型组比较，对叶百部总生物碱各剂量组豚鼠血清和肺组织SP 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

3.4 对叶百部总生物碱对豚鼠气管组织病理改变的影响图1 显示，正常组豚鼠气管黏膜光滑，含有杯状细胞和纤毛细胞的假复层纤毛柱状上皮，未见增厚或水肿，管腔光滑；模型组豚鼠气管黏膜上皮明显增厚，表面粗糙，有肿胀突起；与模型组比较，对叶百部总生物碱各剂量组豚鼠气管黏膜增厚明显改善，表面较光滑，肿胀明显消除。

3.5 对豚鼠肺组织病理改变的影响 图2 显示，正常组豚鼠肺泡壁薄，排列整齐，边界清晰；模型组豚鼠出现肺实变，肺泡明显萎陷，肺泡挤压，边界不清晰；与模型组比较，对叶百部总生物碱各剂量组豚鼠肺实变明显改善，肺泡萎陷明显改善，边界较清晰，挤压程度明显减轻。

表3 对叶百部总生物碱对豚鼠血清和肺组织SP 水平的影响（， n＝10）

表3 对叶百部总生物碱对豚鼠血清和肺组织SP 水平的影响（， n＝10）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

图1 各组豚鼠气管组织病理改变（HE，×400）

图2 各组豚鼠肺组织病理改变（HE，×400）

4 讨论

咳嗽病名最开始记载于《黄帝内经》，是一种常见的临床症状。中医认为，咳嗽是因肺失清轻或肃降致肺气上逆所致，《灵枢经.九针论》 曰：“五脏气，肺主咳”，咳嗽病因复杂，五脏的病变皆可引起咳嗽。百部用于咳嗽治疗，始载于陶景洪的《名医别录》：“白并，味苦无毒。主治肺咳上气，行五脏，令百病不起”。白并即为百部，常用于咳嗽、外感、内伤、暴咳、久嗽等的治疗，为治疗肺痨之要药，对急慢性及各种原因产生的咳嗽，均可治疗，能行五脏，令百病不起，应该是百部可用于治疗各种原因引起咳嗽的主要作用机制。现代研究表明，对叶百部有抗肺炎支原体［7］、抗氧化［8］、中枢镇静、镇痛、止咳化痰［9］、抗菌、杀虫［10］等，可能是对叶百部止咳的相关机制，而对叶百部总生物碱是其发挥药效作用的主要成分［3］。

辣椒素是一种咳嗽刺激剂，主要通过刺激C 纤维受体来引咳。辣椒素刺激气管黏膜疼痛、微循环增加及支气管痉挛，导致局部血浆渗出、血管扩张及水肿，激发Ca2＋为主的阳离子内流，促进SP 和炎症趋化因子释放，引发肺和气管神经源性炎症反应［11］。辣椒素致神经源性炎症的主要神经递质是SP，SP 是具有多种生物活性的11 肽，可直接刺激感觉神经末梢介导神经源性炎症，引起支气管平滑肌收缩、血浆渗出、黏液分泌增加、炎症介质释放增加、血管通透性增加及气道上皮损伤或脱落［12⁃13］。本实验结果表明，辣椒素可引起豚鼠明显咳嗽次数增多，血清和肺组织SP 水平显著升高，气管黏膜上皮明显增厚，表面粗糙及水肿，肺实化，肺泡明显萎陷，表明辣椒素复制的豚鼠咳嗽模型成功。

对叶百部总生物碱可显著减少辣椒素所致豚鼠咳嗽次数及延长咳嗽潜伏期，显著降低血清和肺组织SP 水平，明显减轻气管上皮和肺泡的损伤，这可能与对叶百部总生物碱可行五脏，减少SP 的产生和体内的蓄积，减轻炎症反应有关，其镇咳作用也可能与其中枢性镇咳作用有关［9］。对叶百部总生物碱有明显的拮抗辣椒素致的咳嗽作用，其机制可能与减轻辣椒素对呼吸系统的损伤和抑制神经肽SP 产生及表达有关。